תודה מארי Birne, ארטי Tsiola, Jaymie אסטבס Arelys אוריבה. עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי CUNY Research Foundation ו - הווארד יוז רפואי מכון גרנט תוכנית קיץ לסטודנטים לתואר ראשון (השלוחה) ו-NIH RO3 41702-00-01. המחקר נתמך גם על ידי בקווינס קולג&#39; וחלק הניסויים נעשו על ציוד ממתקן Core for Imaging, ביולוגיה תאית ומולקולרית בקווינס קולג&#39;.

דג הזברה הועלו באמצעות פרוטוקולים סטנדרטיים 13 במתקן בעלי חיים בקווינס קולג&#39; ב 28 ° C. זוגות בודדים או דגים הזדווגויות קבוצה צריכה להיות preformed ואת עוברי כתוצאה ניקה מאוחסנים 28 ° C חממה. בריאות דגים יש לבחון מדי יום. בשלב ההפריה 5 ימים פוסט (DPF), דגים צריכים להיות מופרדים לתוך טנקים בצפיפות 10-15 דג ונכנס לחדר הילדים מתקן דגים. בשביל הפרוטוקול המובא כאן דג הזברה נאספו זחל דרך שלבים מבוגר: 15, 30, 45, 60, 90, 180 DPF. 1. דג הזברה אוסף הנושא קיבעון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר דגים מטנק הגידול באמצעות נטו מקום 0.2% Tricaine להרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום דגים הרדים במי קרח למשך 15 דקות להרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את paraformaldehyde 4% טרי (PFA) ב 1x פוספט שנאגרו מלוחים (PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה דגים שנאספו PFA 4% עבור 1-2 שעות RT אז לילה בשעה 4 ° C בצלחת פטרי עטוף parafilm. זה שומר את הדירה דגים עושה מאוחר יותר דיסקציה הרבה יותר קל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קיבוע, לשטוף פעמיים PBS עם Tween (PBT). דגים אפשר לשמור PBT ב 4 ° C עד 10 ימים. </li></ol> 2. מדידת דגים לנתיחה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגים מקום יחיד לתוך חצי צלחת פטרי מלאות PBS טרי ולהניח אותה על צדה הימני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת אורך הדג מהחרטום לבסיס של הזנב (peduncle הזנב), לא כולל סנפירי הזנב, באמצעות דיגיטלי מ&quot;מ קליפר (איור 1). זהו אורך סטנדרטי (SL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל דג ניתן להקצות מספר / אות על מנת לאפשר שילוב דגים בודדים לב גזור וכתוצאה מכך להיות במעקב לצורך ניתוח מאוחר יותר. הנתונים, לרבות מספר המניות הורית, גיל קיבעון, מדידות SL, נכנסו לתוך גיליון אלקטרוני ומאורגן על התוויות הללו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני, דיסקציה תווית צינור רצועות PCR עם מספר מעקב מוקצה ולמלא עם PBT או פתרון אחר המתאים לניתוח נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המזרח צד דגים הגחון עד בצלחת פטרי תוך ייצוב הגוף עם מלקחיים מחזיק את הראש בין העיניים הזימים (איור 2). </li></ol> דגים קטנים יותר (יותר מאשר SL 12mm): <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> א) באמצעות מלקחיים חדות, או מחט מיקרו בעריסה סיכה, להסיר את שרירי החזה ועל הסנפירים מהגוף כדי לחשוף את הלב. בתנועה מתמדת של מלקחיים במהלך דיסקציה יכול לגרום זרמים PBT כי המהלך דגים. זה בעייתי במיוחד עבור דגים קטנים יותר, ובכך מחט מיקרו ניתן להשתמש כדי להסיר את שרירי החזה ועל הסנפירים ולפתוח את חלל הגוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> א) בעדינות להשתמש במלקחיים כדי לגרוף את הלב מתוך חלל מתחת אטריום. לחלופין, דגים מסוימים ייתכן שתוכל להסיר את הלב על ידי משיכתו בעדינות החוצה בולבוסי ושאר הלב יבואו בעקבותיו. היזהרו במיקום של אטריום אם באמצעות טכניקה זו כפי שהוא יכול להיפגע בקלות. אם יש רקמה נוספת שמגיע עם הלב, זה בסדר, ניתן לפנות לאחר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> א) אם הדג מכיל סמן לב ניאון כגון Tg (myl7: GFP) twu34, היקף השימוש פלורסנט לנתיחה כדי לוודא הסרה של הלב על ידי בתפרחת (איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> א) כאשר מסירים את הלב מחלל, להשתמש במלקחיים כדי להחזיק את הלב מחט מיקרו להסיר רקמה נוספת שאינה לב רירית epicardial מבחוץ של הלב. </li></ol> דגים גדולים (יותר מ SL 12mm): <ol start="4" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב) שימוש באביב טיפל מיקרו מספריים, לעשות שלושה חתכים בעומק של פחות מ 1 מ&quot;מ 1 - חתך רוחבי דרך הזימים 2 - חתך רוחבי על בטן קדמית 3 - לחתוך sagittal בצד הגחון חיבור שני חתכים (איור 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב) באמצעות מלקחיים חדה להסיר את שרירי החזה ועל הסנפירים מהגוף כדי לפתוח את חלל הגוף וחושפים את רקמת כסוף של קרום הלב (איור 5 א). הסר רקמות קרום הלב והלב יהיה גלוי (איור 5 ב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב) השתמש מיקרו עם מספריים בכדי לחתוך את העורק מחובר arteriosus בולבוסי, הממוקם מעולה ללב. ברגע זה הוא חתך עורק, הניח את קצות מלקחיים תחת אטריום, להשתמש במלקחיים כדי לגרוף את הלב מתוך חלל. אם יש רקמה נוספת שמגיע עם הלב, זה בסדר גמור וניתן להסירו מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב) לאחר לב יוסר חלל, להשתמש בשני מלקחיים להחזיק את הלב ולהסיר רקמה נוספת, או זוג אחד של מלקחיים להחזיק את הלב מיקרו מחט כדי להסיר תוספת, ללא רקמת לב. רירית epicardial, ניכר על ידי פיגמנט שחור שלה, ניתן להסיר מבחוץ של הלב אם הרצוי על ידי מגרד בעדינות את הרקמה. </li></ol> 3. צילום של לבבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 23g / L מזין צלחת פטרי אגר אגר הקרושה ולכסות עם PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מלקחיים, לעשות היטב אגר המאפשר ללב לנוח בכיוון הרצוי עבור הצילום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Removהדואר הלב מהצינור PCR ידי החזקת קצה בולבוסי עם מלקחיים בתוקף. מניחים את הלב בצלחת אגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המזרח לב אגר לצלם. המדגם ניתן לסובב אחרי כל תמונה לכל אוריינטציות אפשרי (איור 6). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בזמן חשיפה לאור תקורה קצר לצלם את הלבבות. בצע התאמות עבור איכות האור באמצעות חשיפה כנדרש בכדי להשיג את התמונה הטובה ביותר. </li></ol> 4. נציג תוצאות: דוגמה לב היטב גזור לנקות מוצג אוריינטציות מרובים באיור 6. בלב כל אחד יהיה כמה הבדלים במורפולוגיה הכללית, אבל הלב צריך להיות מלא, המכיל החדר אטריום שלם, arteriosus בולבוסי. כמה דוגמאות של וריאציה זו במורפולוגיה הכולל מוצגים באיור 7. הרקמה כתמים שחורים epicardial יכול להסיר גם מהלב. <img src="/files/ftp_upload/3165/3165fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. מדדו את הדג מהחרטום עד הזנב peduncle באמצעות מ&quot;מ קליפר דיגיטלי. <img src="/files/ftp_upload/3165/3165fig2.jpg" alt="איור 2"/> איור 2. החזיקו את הדג עם מלקחיים בין העיניים הזימים. <img src="/files/ftp_upload/3165/3165fig3.jpg" alt="איור 3"/> איור 3 סמן לב ספציפית מהונדס ניאון כגון Tg (myl7: GFP). Twu34, המוצג כאן, יכול לסייע חזותי לבבות גזור מן הדגים הקטנים. <img src="/files/ftp_upload/3165/3165fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4 שלושה חתכים כדי להסיר את שרירי החזה והעור: 1 - חתך רוחבי דרך הזימים 2 - חתך רוחבי על בטן קדמית 3 - לחתוך sagittal בצד הגחון חיבור שני חתכים.. <img src="/files/ftp_upload/3165/3165fig5.jpg" alt="איור 5"/> . איור 5 אותיות שחור תווית לתאי הלב: arteriosus בולבוסי (BA), החדר (v), ואת אטריום (א). A-חלל הגוף העליון פתוח להראות את הרקמה כסוף של קרום הלב. B-לאחר הסרת קרום הלב, הלב גלוי להסיר בקלות. <img src="/files/ftp_upload/3165/3165fig6.jpg" alt="איור 6"/> איור 6. אוריינטציות שונות של הלב מוצגים. אותיות שחור תווית לתאי הלב: arteriosus בולבוסי (BA), החדר (v), ואת אטריום (א). החצים מצביעים גריי המיקום והכיוון של הלב התייחסות למיקום הטבעי בגוף: קדמית (A), האחורי (P), הגב (ד), הגחון (V), שמאלה (L), ומימין (R). בר מציין סולם 400μm. A-הגחון נוף של הלב B-הגבי נוף של הלב C-לרוחב לצפות מהצד השמאלי D-לרוחב לצפות מהצד הימני <img src="/files/ftp_upload/3165/3165fig7.jpg" alt="איור 7"/> איור 7. מורפולוגיה של לבבות בגדלים שונים מוצג. אותיות שחור תווית לתאי הלב: arteriosus בולבוסי (BA), החדר (v), ואת אטריום (א). בר סולם הצביעו 400 מיקרומטר. AC-Hearts טופס דגים עם SL פחות 12mm DF-Hearts טופס דגים עם SL יותר 12mm

<ol>
	<li>Ahmad, N., Long, S., Rebagliati, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+southpaw+joins+the+roster:+the+role+of+the+zebrafish+nodal-related+gene+southpaw+in+cardiac+LR+asymmetry.">A southpaw joins the roster: the role of the zebrafish nodal-related gene southpaw in cardiac LR asymmetry.</a> Trends Cardiovasc Med. 14, 43-49 (2004).</li><li>Armstrong, E. J., Bischoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heart+valve+development:+endothelial+cell+signaling+and+differentiation.">Heart valve development: endothelial cell signaling and differentiation.</a> Circ Res. 95, 459-470 (2004).</li><li>Bakkers, J., Verhoeven, M. C., Abdelilah-Seyfried, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shaping+the+zebrafish+heart:+from+left-right+axis+specification+to+epithelial+tissue+morphogenesis.">Shaping the zebrafish heart: from left-right axis specification to epithelial tissue morphogenesis.</a> Dev Biol. 330, 213-220 (2009).</li><li>Glickman, N. S., Yelon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+development+in+zebrafish:+coordination+of+form+and+function.">Cardiac development in zebrafish: coordination of form and function.</a> Semin Cell Dev Biol. 13, 507-513 (2002).</li><li>Heicklen-Klein, A., McReynolds, L. J., Evans, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+the+zebrafish+model+to+study+GATA+transcription+factors.">Using the zebrafish model to study GATA transcription factors.</a> Semin Cell Dev Biol. 16, 95-106 (2005).</li><li>Schoenebeck, J. J., Yelon, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Illuminating+cardiac+development:+Advances+in+imaging+add+new+dimensions+to+the+utility+of+zebrafish+genetics.">Illuminating cardiac development: Advances in imaging add new dimensions to the utility of zebrafish genetics.</a> Semin Cell Dev Biol. 18, 27-35 (2007).</li><li>Beis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+cellular+analyses+of+zebrafish+atrioventricular+cushion+and+valve+development.">Genetic and cellular analyses of zebrafish atrioventricular cushion and valve development.</a> Development. 132, 4193-4204 (2005).</li><li>Lepilina, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+dynamic+epicardial+injury+response+supports+progenitor+cell+activity+during+zebrafish+heart+regeneration.">A dynamic epicardial injury response supports progenitor cell activity during zebrafish heart regeneration.</a> Cell. 127, 607-619 (2006).</li><li>Wills, A. A., Holdway, J. E., Major, R. J., Poss, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+addition+of+new+myocardial+and+epicardial+cells+fosters+homeostatic+cardiac+growth+and+maintenance+in+adult+zebrafish.">Regulated addition of new myocardial and epicardial cells fosters homeostatic cardiac growth and maintenance in adult zebrafish.</a> Development. 135, 183-192 (2008).</li><li>Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normal+table+of+postembryonic+zebrafish+development:+staging+by+externally+visible+anatomy+of+the+living+fish.">Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish.</a> Dev Dyn. 238, 2975-3015 (2009).</li><li>Huang, C. J., Tu, C. T., Hsiao, C. D., Hsieh, F. J., Tsai, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Germ-line+transmission+of+a+myocardium-specific+GFP+transgene+reveals+critical+regulatory+elements+in+the+cardiac+myosin+light+chain+2+promoter+of+zebrafish.">Germ-line transmission of a myocardium-specific GFP transgene reveals critical regulatory elements in the cardiac myosin light chain 2 promoter of zebrafish.</a> Dev Dyn. 228, 30-40 (2003).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Zebrafish+Book,+A+guide+for+the+laboratory+use+of+zebrafish+(Danio+rerio).">The Zebrafish Book, A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio rerio).</a> , (1995).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

אלה שיטות לניתוח הלב דג הזברה של דגים שלאחר עובריים מאפשר הסרה מלאה של הלב ניזוק. אמנם שיטה זו היא פשוטה, ומספק מדריכים עבור חתכים חיצוניים שימנעו פגיעה בלב, יד יציבה חיונית דגים קטנים יותר. צעד מרכזי במהלך דיסקציה היא לזהות את קרו...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> חומר </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> EMD </td><td> PX0055 </td><td> .04g/mL ב PBS </td></tr><tr><td> מלקחיים # 55 </td><td> FST </td><td> 11295-51 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרו מספריים </td><td> FST </td><td> 15005-08 </td><td></td></tr><tr><td> בעל פין </td><td> FST </td><td> 26016-12 </td><td></td></tr><tr><td> מיקרו מחטים </td><td> FST </td><td> 10130-10 </td><td></td></tr><tr><td> מזין אגר </td><td> BBL </td><td> 11472 </td><td> 23g / L ב מזוקקים H 2 O </td></tr><tr><td> צלחות פטרי </td><td> BD פלקון </td><td> 351029 </td><td></td></tr><tr><td> 8-PCR צינור רצועות </td><td> ארה&quot;ב מדעי </td><td> 1402-2500 </td><td></td></tr><tr><td> Digital Caliper </td><td> פישר סיינטיפיק </td><td> 14-648-17 </td><td></td></tr></tbody></table>

heart dissection in larval, juvenile and adult zebrafish, danio rerio

דג הזברה הפכו אורגניזם מודל מועיל ומעשי ללימוד התפתחות הלב העוברי (ראה הסקירות האחרונות 1-6), לעומת זאת, העבודה בוחנת שלאחר עובריים באמצעות פיתוח מבוגר לב הוגבל 7-10. בחינת המורפולוגיה שינוי של הלב התבגרות והזדקנות מוגבלים על ידי חוסר של טכניקות עבור הבימוי ובידוד לבבות צעירים ומבוגרים. על מנת לנתח את התפתחות הלב על תוחלת החיים של הדגים, אנו לנתח לבבות דג הזברה בשלבים רבים לצלם אותם לניתוח נוסף 11. המאפיינים המורפולוגיים של הלב יכול בקלות לכימות ולבבות בודדים ניתן לנתח עוד יותר על ידי שורה של שיטות סטנדרטיות. דג הזברה לצמוח בקצב משתנה התבגרות בקורלציה טובה עם גודל הדג לגיל, וכך, לאחר קיבוע, אנחנו מצלמים ולמדוד אורך דגים כמדד של התבגרות הדג. פרוטוקול זה מסביר two ברורים, טכניקות גודל לנתיחה תלוי על דג הזברה, החל אורך הזחלים 3.5mm סטנדרטית (SL) עם לבבות של אורך החדר 100μm (VL), על מבוגרים, עם SL של 30mm ו VL 1mm או גדולים יותר. דגים הזחל למבוגרים יש גוף שונה לגמרי ומורפולוגיה איברים. הזחלים הם לא רק קטן יותר באופן משמעותי, יש להם פחות פיגמנט כל איבר הוא ויזואלית קשה מאוד לזהות. מסיבה זו, אנו משתמשים בטכניקות שונות לנתיחה. השתמשנו מראש לנתיחה קיבעון הליכים, כפי שגילינו כי לבבות גזור ישירות לאחר euthanization יש מורפולוגיה משתנה יותר, עם בלון רופף מאוד כמו אטריה בהשוואה לבבות להסיר קיבוע הבאה. הדגים קבוע לפני לנתיחה, לשמור במורפולוגיה vivo ואת המיקום קאמרית (מידע לא מוצג). בנוסף, למטרות הדגמה, אנו מנצלים את הלב (שריר הלב) ספציפי GFP מהונדס Tg (myl7: GFP) twu34 (12), אשר מאפשר לנו לדמיין את הלב כולו והוא שימושי במיוחד בשלבים הראשונים בהתפתחות כאשר הלב מורפולוגיה היא ברורה פחות הרקמות הסובבות. Dissection הלב עושה ניתוח נוסף של התא וביולוגיה מולקולרית הבסיסית לפיתוח לב התבגרות משתמש הכלאה באתרו, אימונוהיסטוכימיה, מיצוי RNA או שיטות אנליטיות אחרות קל יותר דג הזברה שלאחר עובריים. פרוטוקול זה יספק טכניקה ערך לחקר הזדקנות התבגרות התפתחות הלב.

Watch this Scientific Journal Video about Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio at JoVE.com

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

שיטה ברורה, תקנית לנתיחה ובידוד של הלב דג הזברה בשלבים התפתחותיים מרובים מתוארים. טכניקות ביאור וכימות הם דנו גם.

הלב Dissection ב הזחל, דג הזברה לנוער ו למבוגרים, Danio rerio</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

heart-dissection-in-larval-juvenile-and-adult-zebrafish-danio-rerio

Research

JoVE Journal

Biology

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

21.4K Views.  Queens College, City University of New York. שיטה ברורה, תקנית לנתיחה ובידוד של הלב דג הזברה בשלבים התפתחותיים מרובים מתוארים. טכניקות ביאור וכימות הם דנו גם.

Video: Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Dissection of Larval CNS in Drosophila Melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to examine the expression of various novel and marker proteins.  Staining of whole larvae is impractical because the tough cuticle prevents antibodies from penetrating inside the body cavity.  In order to stain these tissues it is necessary to dissect the animal prior to fixing and staining.  In this article we demonstrate how to dissect Drosophila larvae without damaging the CNS.  Begin by tearing the larva in half with a pair of fine forceps, and then turn the cuticle "inside-out" to expose the CNS.  If the dissection is performed carefully the CNS will remain attached to the cuticle.  We usually keep the CNS attached to the cuticle throughout the fixation and staining steps, and only completely remove the CNS from the cuticle just prior to mounting the samples on glass slides.  We also show some representative images of a larval CNS stained with Eve, a transcription factor expressed in a subset of neurons in the CNS.  The article concludes with a discussion of some of the practical uses of this technique and the potential difficulties that may arise.

In this article we demonstrate how to dissect the central nervous system from third instar Drosophila larvae.

Dissection של מערכת העצבים המרכזית הזחל ב תסיסנית melanogaster

The central nervous system (CNS) of Drosophila larvae is complex and poorly understood.  One way to investigate the CNS is to use immunohistochemistry to ...

Drosophila Larval NMJ Dissection

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use of the Drosophila motor system is due to its high accessibility. It can be analyzed with single-cell resolution. There are 30 muscles per hemisegment whose arrangement within the peripheral body wall are known. A total of 35 motor neurons attach to these muscles in a pattern that has high fidelity. Using molecular biology and genetics, one can create transgenic animals or mutants. Then, one can study the developmental consequences on the morphology and function of the NMJ. In order to access the NMJ for study, it is necessary to carefully dissect each larva. In this article we demonstrate how to properly dissect Drosophila larvae for study of the NMJ by removing all internal organs while leaving the body wall intact. This technique is suitable to prepare larvae for imaging, immunohistochemistry, or electrophysiology.

This protocol demonstrates how to dissect Drosophila larvae in preparation for immunohistochemistry and/or imaging of the neuromuscular junction.

תסיסנית הזחל Dissection NMJ

The Drosophila neuromuscular junction (NMJ) is an established model system used for the study of synaptic development and plasticity. The widespread use ...

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

Dissection גרוס פיין epithelia של האוזן הפנימית חושית למבוגרים דג הזברה ( Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissection של איברים מן דג הזברה למבוגרים

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells form, and how they interact with their environment is therefore crucial for understanding development, homeostasis and disease. The ovary of the fruit fly Drosophila melanogaster has served as an influential model for the interaction of germ line stem cells (GSCs) with their somatic support cells (niche) 1, 2. The known location of the niche and the GSCs, coupled to the ability to genetically manipulate them, has allowed researchers to elucidate a variety of interactions between stem cells and their niches 3-12.
Despite the wealth of information about mechanisms controlling GSC maintenance and differentiation, relatively little is known about how GSCs and their somatic niches form during development. About 18 somatic niches, whose cellular components include terminal filament and cap cells (Figure 1), form during the third larval instar 13-17. GSCs originate from primordial germ cells (PGCs). PGCs proliferate at early larval stages, but following the formation of the niche a subgroup of PGCs becomes GSCs 7, 16, 18, 19. Together, the somatic niche cells and the GSCs make a functional unit that produces eggs throughout the lifetime of the organism.
Many questions regarding the formation of the GSC unit remain unanswered. Processes such as coordination between precursor cells for niches and stem cell precursors, or the generation of asymmetry within PGCs as they become GSCs, can best be studied in the larva. However, a methodical study of larval ovary development is physically challenging. First, larval ovaries are small. Even at late larval stages they are only 100&mu;m across. In addition, the ovaries are transparent and are embedded in a white fat body. Here we describe a step-by-step protocol for isolating ovaries from late third instar (LL3) Drosophila larvae, followed by staining with fluorescent antibodies. We offer some technical solutions to problems such as locating the ovaries, staining and washing tissues that do not sink, and making sure that antibodies penetrate into the tissue. This protocol can be applied to earlier larval stages and to larval testes as well.

Dissection and Staining of Drosophila Larval Ovaries

How niches and stem cells form during development is an important question with practical implications. In the Drosophila ovary, germ line stem cells and their somatic niches form during larval development. This video demonstrates how to dissect, stain and mount female gonads from late third instar (LL3) Drosophila larvae.

Dissection ו מכתים של תסיסנית הזחל השחלות

Many organs depend on stem cells for their development during embryogenesis and for maintenance or repair during adult life. Understanding how stem cells ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissection של הכליה דג הזברה למבוגרים

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and behavioural research. As a vertebrate, zebrafish share considerable genetic sequence similarity with humans and are being used as an animal model for various human disease conditions. The advantages of zebrafish in comparison to other common vertebrate models include high fecundity, low maintenance cost, transparent embryos, and rapid development. Due to the spur of interest in zebrafish research, the need to establish and maintain a productive zebrafish housing facility is also increasing. Although literature is available for the maintenance of a zebrafish laboratory, a concise video protocol is lacking. This video illustrates the protocol for regular housing, feeding, breeding and raising of zebrafish larvae. This process will help researchers to understand the natural behaviour and optimal conditions of zebrafish husbandry and hence troubleshoot experimental issues that originate from the fish husbandry conditions. This protocol will be of immense help to researchers planning to establish a zebrafish laboratory, and also to graduate students who are intending to use zebrafish as an animal model.

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

This protocol outlines regular maintenance and care to maintain optimal conditions for zebrafish husbandry. The video illustrates the protocol for system maintenance, regular housing, feeding, breeding, and raising of zebrafish larvae.

טיפול קבוע ותחזוקה של דג זברה (<em&gt; Danio rerio</em&gt;) מעבדה: מבוא

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present methods for the development of assays to query potentially clinically significant nonsynonymous changes using in vivo complementation in zebrafish. Zebrafish (Danio rerio) are a useful animal system due to their experimental tractability; embryos are transparent to enable facile viewing, undergo rapid development ex vivo, and can be genetically manipulated.1 These aspects have allowed for significant advances in the analysis of embryogenesis, molecular processes, and morphogenetic signaling. Taken together, the advantages of this vertebrate model make zebrafish highly amenable to modeling the developmental defects in pediatric disease, and in some cases, adult-onset disorders. Because the zebrafish genome is highly conserved with that of humans (~70% orthologous), it is possible to recapitulate human disease states in zebrafish. This is accomplished either through the injection of mutant human mRNA to induce dominant negative or gain of function alleles, or utilization of morpholino (MO) antisense oligonucleotides to suppress genes to mimic loss of function variants. Through complementation of MO-induced phenotypes with capped human mRNA, our approach enables the interpretation of the deleterious effect of mutations on human protein sequence based on the ability of mutant mRNA to rescue a measurable, physiologically relevant phenotype. Modeling of the human disease alleles occurs through microinjection of zebrafish embryos with MO and/or human mRNA at the 1-4 cell stage, and phenotyping up to seven days post fertilization (dpf). This general strategy can be extended to a wide range of disease phenotypes, as demonstrated in the following protocol. We present our established models for morphogenetic signaling, craniofacial, cardiac, vascular integrity, renal function, and skeletal muscle disorder phenotypes, as well as others.

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

Here, we present a systematic approach for developing physiologically relevant, sensitive and specific in vivo assays for interpreting variation in human pathology. Transient genetic manipulation via microinjection of WT and mutant human mRNA and morpholino (MO) antisense oligonucleotides harness the tractability of the developing zebrafish embryo to rapidly assay pathogenic mutations, especially, but not exclusively, in the context of human developmental disorders.

בדוגמנות Vivo של הגנום האנושי החולנית באמצעות Danio rerio

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

Gavaging Adult Zebrafish

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or agents in solutions for scientific research. Current methods for administering compounds orally to adult zebrafish are inaccurate due to variability in voluntary consumption by the fish. A gavage procedure was developed to deliver precise quantities of infectious agents to zebrafish for study in biomedical research. Adult zebrafish over 6 months of age were anesthetized with 150 mg/L of buffered MS-222 and gavaged with 5 &mu;l of solution using flexible catheter implantation tubing attached to a cut 22-G needle tip. The flexible tubing was lowered into the oral cavity of the zebrafish until the tip of the tubing extended past the gills (approximately 1 cm). The solution was then injected slowly into the intestinal tract. This method was effective 88% of the time, with fish recovering uneventfully. This procedure is also efficient as one person can gavage 20-30 fish in one hour. This method can be used to precisely administer agents for infectious diseases studies, or studies of other compounds in adult zebrafish.

The increasing use of zebrafish as an animal model requires the development of effective methods for the delivery of known quantities of compounds and solutions. The gavage procedure described below allows for the oral delivery of precise volumes of solution reliably, safely and efficiently to adult zebrafish.

Gavaging דג הזברה למבוגר

The zebrafish has become an important in vivo model in biomedical research. Effective methods must be developed and utilized to deliver compounds or ...