מחקר זה נתמך על ידי Juvenile Diabetes Research Foundation מענק 5-2007-97 (עד VEP), על ידי המכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול כליות מענקים R01DK064973 (עד VEP), R01DK48494 (עד LHP), T32DK07074 (תמיכה SCE), K01DK083552 (כדי MDK), ועל ידי P60DK20595 לאוניברסיטת מחקר סוכרת שיקגו מרכז הדרכה. התוכן הוא באחריות הבלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצגים את הדעות הרשמיות של NIDDK או NIH.

1. טרום הזרקת תכשירים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fast הדגים לפחות 24 שעות לפני הזריקה. זה יהיה לרוקן את המעיים (בטן) תוכן הנורה. פרוטוקול צום הבסיסי הוא להעביר את הדגים, בצפיפות הרגילה שלהם, כדי לנקות את הטנק, אז לחתול מזון. במשך הצום לטווח ארוך הדורש תנאים מחמירים יותר (למשל, ללימודי הגלוקוז בדם), ראה שיקולים נוספים בדיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון Cortland מלח (פרי et al. 1984). עבור נפח של 100 מ&quot;ל, לפרק את הבאים מים מזוקקים: 725 מ&quot;ג NaCl (124.1 mM) 38 מ&quot;ג KCl (5.1 mM) 41 מ&quot;ג Na 2 HPO 4 (2.9 mM) 24 מ&quot;ג MgSO 4 ∙ 7H 2 O (1.9 mM) 16 מ&quot;ג CaCl 2 ∙ 2H 2 O (1.4 mM) 100 מ&quot;ג NaHCO 3 (11.9 mM) 4 גרם Polyvinylpyrrolidone (PVP) (4%) 1,000 יחידות הפרין USP סנן לעקר ולאחסן ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המיקרוסקופ. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את בסיס מיקרוסקופ בניילון נצמד להגנה במקרה של נזילות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשים מגבת נייר על גבי עטיפת הפלסטיק. הטבלה כירורגית תשב על גבי מגבת נייר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום להתאים להתמקד ידי הצגת הטבלה כירורגית התמקדות הספוג. </li></ul> טיפ: לשים את האצבע על החלק העליון של הספוג ולהתמקד זה. זה יהיה לבטל או לצמצם עוד יותר התאמת המוקד פעם הדגים על השולחן כירורגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את הדגים. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים כוס 500 מ&quot;ל כ 1 / 3 מלא עם מתקן מים ודגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרה את האיזון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף הדגים באמצעות הרשת. וויק עודפי המים מן הרשת ודגים על ידי לחיצה קצרה מספיגה נטו על מגבות נייר. מעבירים את הדג כוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את הדגים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הדגים לאקווריום נקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת כל הדגים שקל למכל שלו שכותרתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חשב את נפח הזרקה לדגים זה מבוסס על משקל הדגים. </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את המזרק וציוד הזרקת בנושא. עבור זריקה, אנו ממליצים מחט 35G פלדה משופעים ו microsyringe 10 NanoFil μl. הכן את המזרק NanoFil צינורות silflex הבאים הוראות היצרן. חשוב להסיר כל הבועות מן המזרק צינורות. לאחר מילוי במזרק צינורות, לעלות את המזרק על המשאבה, והתוכנית נפח הזרקה לדגים הראשונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את הטבלה כירורגית. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גזור ספוג רך (כגון # L800-D, Jaece תעשיות), כך הוא כ 20 מ&quot;מ גובה. על פניו שטוח, לעשות חתך כי הוא 10-15 מ&quot;מ עמוק. לחתוך זוהי שוקת כי תקיים את הדג להזרקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הספוג לתוך צלחת פטרי 60 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את צלחת פטרי עם ספוג לתוך מכסה מתאים בגודל קופסת פיפטה קצה. המכסה צריך להיות גדול מספיק כדי להכיל מים מנת לשמור על חום ספוג, אבל זה צריך להיות רדוד מספיק כדי לא להפריע. אנו משתמשים המכסה מהקופסה P200 טיפ כי הוא 11.4 ס&quot;מ אורך x 7.7 ס&quot;מ רוחב X 1.5 ס&quot;מ ד </li></ul> שלושת הפריטים שנאספו יחד (ספוג בצלחת פטרי במכסה הקופסה) מהווים את שולחן הניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את ההרדמה. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע באמצעות קוביות קרח מרוסק עשוי מתקן מים ודגים. </li></ul> טיפ: שימוש מגשי קוביית קרח טיפוסי, זה ייקח 3 מגשי להרדים 10-12 דגים. <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלאים דלי קרח נקי עם קרח כתוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את השולחן כירורגית לתוך מיכל גדול כמו מיכל 2.4 ליטר Rubbermaid אחסון מזון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים מעט מים מתקן (חם) לתוך המיכל החיצוני ואת שולחן הניתוח. שמור מילואים של מתקן מים חמים בקרבת מקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים מדחום לתוך המיכל החיצוני. </li></ul></li></ol> 2. , הזרקת הרדמה והתאוששות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את המיכל החיצוני הרדמה כירורגית פלוס שולחן סמוך המיקרוסקופ. האם את הדלי של שבבי קרח הסמוך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הביאו את טמפרטורת המים עד 17 ° C על ידי הוספת קוביות קרח. חשוב: אל תלך מתחת 17 ° C לצעד זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש נטו להעביר את הדגים למיכל החיצוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאט לאט להוסיף קוביות קרח כדי המיכל להביא את הטמפרטורה עד 12 מעלות צלזיוס, במשך מספר דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התנהגות צג דגים: בגיל 17 מעלות צלזיוס או מעט נמוך יותר, בדרך כלל הדג יתפשט סנפירי החזה שלה אופקית, התנשפות, יש תנועות operculum מהירה. כאשר הטמפרטורה יורדת, דגים ישחו יותר לאט ולבסוף להפסיק לשחות. כאשר מטוס של הרדמה כירורגית הוא התקרב, מתנשם יפסיק ותנועות operculum יואט. הדג מוכן להזרקה כאשר הוא אינו מגיב מטופל. במשך רוב הדגים, 12 ° C היא מספיקה. דגים גדולים יותר עשויים לדרוש wa קרter. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הטמפרטורה הנדרשת היא הגיעה (~ 12 ° C או קר), לחץ על הספוג כדי להרוות את זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את האצבעות במים קרים דיים, כך שהם לא לחמם את הדגים ולהביא אותו מתוך הרדמה במהלך הטיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם אצבעות קרות, בעדינות להעביר את הדגים לשוקת של הספוג. מקם את הדג עם הבטן מעלה את הזימים בשוקת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר במהירות את השולחן כירורגית לשלב מיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבודה במהירות, בזהירות להכניס את המחט לתוך קו האמצע בין סנפירי גחון. המחט צריכה נקודה cranially להיות מוכנס קרוב חגורת האגן מאשר בפי הטבעת. אתה אמור להיות מסוגל להרגיש כאשר המחט עמוק אל הקיר הגוף. להזריק את נפח המתאימה לשלוף את המחט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר ההזרקה, מיד להעביר את הדג בחזרה למים חמים שלה (~ 28.5 ° C) טנק להתאוששות ידי שחרור דגים מהספוג מעל המים טנק. עצה: אם הדג לא מתחיל מיד שחייה, לסייע לה להתאושש על ידי בעדינות מתערבלים המים לכיוון הזימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את המחט. מדי פעם בקנה מידה ניתן יהיה לעקל, ויש להסירם לפני הזריקה הבאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור זריקות לאחר מכן, להשתמש במתקן מים חמים כדי להביא את טמפרטורת המים הרדמה בחדר האחורי עד 17 ° C לפני מציגה את הדג הבא. </li></ol> 3. נציג תוצאות: <img src="/files/ftp_upload/2126/2126fig1.jpg" alt="איור 1" /> באיור 1. התוצאות הבאות נציג intraperitoneal הזרקה של גלוקוז מ&quot;ג / גרם 0.5 או רכב. דגים הם צמו במשך 72 שעות לפני הזריקה. ציר X מראה, שלאחר זמן ההזרקה. ממוצע ± SEM.

<ol>
	<li>Perry, S. F., Davie, P. S., Daxboeck, C., Ellis, A. G., Smith, D. G., Hoar, W. S., Randall, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perfusion+methods+for+the+study+of+gill+physiology.">Perfusion methods for the study of gill physiology.</a> Fish Physiology Volume X: Gills, Part B: Ion and Water. , 325-388 (1984).</li><li>Brown, L. A., Stoskopf, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anesthesia+and+restraint.">Anesthesia and restraint.</a> Fish Medicine. , 79-90 (1993).</li><li>Eames, S. C., Philipson, L., Prince, V. E., Kinkel, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+sugar+measurement+in+zebrafish+reveals+dynamics+of+glucose+homeostastis.">Blood sugar measurement in zebrafish reveals dynamics of glucose homeostastis.</a> Zebrafish. 7, 205-213 (2010).</li><li>Chavin, W., Young, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+in+the+determination+of+normal+serum+glucose+levels+of+goldfish+Carassius+auratus+L.">Factors in the determination of normal serum glucose levels of goldfish Carassius auratus L.</a> Comp Biochem Physiol. 33, 629-653 (1970).</li><li>Groff, J. M., Zinkl, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematology+and+clinical+chemistry+of+cyprinid+fish.+Common+carp+and+goldfish.">Hematology and clinical chemistry of cyprinid fish. Common carp and goldfish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 2, 741-776 (1999).</li><li>Brand, M., Granato, M., Nusslein-Volhard, C., Nusslein-Volhard, C., Dahm, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+and+raising+zebrafish.">Keeping and raising zebrafish.</a> Zebrafish: A Practical Approach. , 7-37 (2002).</li><li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Zebrafish Book. , (1995).</li><li>Iwama, G. K., Ackerman, P. A., Hochachka, P. W., Mommsen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anaesthetics.">Anaesthetics.</a> Biochemistry and Molecular Biology of Fishes, Volume 3: Analytical Techniques. , 1-15 (1994).</li><li>Reavill, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Common+diagnostic+and+clinical+techniques+for+fish.">Common diagnostic and clinical techniques for fish.</a> Vet Clin North Am Exot Anim Pract. 9, 223-235 (2006).</li><li>Stoskopf, M. K., Stoskopf, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surgery.">Surgery.</a> Fish Medicine. , 91-97 (1993).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הזרקת intraperitoneal כרוכה בחמישה שלבים: בצום, שקילה, הרדמה, זריקה, והתאוששות. לכל שלב יש את שיטות העבודה המומלצות שיכול להבטיח הצלחה. הצלחה כוללת החולה דגים בריאים, כמו גם תוצאות הניסוי טוב. צום: מהיר 24 שעות ביממה, צריך לרוקן את הנורה מעיים. נוהג זה נלקח מתוך הספרות דגים וטרינרי (למשל, בראון 1993). שיקולים נוספים הם בצום בהמשך. לטווח הארוך צום: מצאנו כי צום של 72 שעות נדרשת ירידה רמת הסוכר בדם לרמה הבסיסית לפני הזרקת (איימס et al, 2010).. מצאנו גם כי מחקרים גלוקוז יש מספר הליכים הנדרשים על מנת להבטיח כי דגים הם צמו כראוי. התחל עם טנק נקי (ללא פסולת על הקרקעית). טנקים צריך להיות מחובר, מסומן בבירור &quot;צום&quot;, וגם במקום שבו נלהב טיפול אנשי הדג לא להאכיל אותם. הערכת הסביבה החיצונית של הטנק לנקוט צעדים כדי למנוע את הדג מלהיות הדגיש מהפרעות, כמו מתח ידועה להעלות את רמת הסוכר בדם (צ&#39;אווין ו יאנג, 1970;. גרוף et al, 1999). לדוגמה, היה לנו ניסוי צום בו רדיו הופעל יומי על הספסל כי החזיק את הטנקים דגים. מצאנו כי הגלוקוז בדם היה גבוה במיוחד והגיע למסקנה כי הדגים היו לחוצים על ידי תנודות. גורם לחץ נוסף הוא הצפיפות. דגים יש לשמור על צפיפות העולה בקנה אחד עם נוהלי בעלי טוב דגים. לקבלת המלצות, לראות et al ברנד. (2002) ו Westerfield (1995). היו לנו תוצאות טובות צום הדגים שלנו בצפיפות של דגים באקווריום 10-12 9 ליטר (עם 3 שכבות של גולות תופס כמה נפח זה). הפרדת המינים עלולה לגרום ללחץ, לכן אנו ממליצים לשמור על אוכלוסייה מעורבת מין במהלך הצום. משמעות הדבר היא כי ניתן להניח ביצים, ואת הביצים צריך להיות מוחרם, כך שהם לא יהיו נאכלים. דרך פשוטה לעקל ביצים היא לכסות את תחתית המיכל עם 2-3 שכבות של גולות. איכות המים צריך להיות מתוחזק על ידי הוצאת ביצים פסולת על ידי החלפת 10-15% ממי האקווריום, מדי יום. להסרת ביצים פסולת, והעברתם עובד היטב. שקילה: כששוקלים דגים כי הם לא הרדים, יש להקפיד למזער העברת מים מן הרשת אל תוך הכוס, כדי להבטיח שקילה מדויקת. אם נטו (עם דגים) נמחקת על מגבות נייר, רוב המים העודפים ניתן להסיר, ואת משקל ניתן למדוד במדויק. זה יכול להיות קל יותר להרדים את הדג לפני שקילה, אבל אנחנו לא בחנו את ההשפעות האפשריות של הרדמה דג פעמיים ביום אחד. בדקנו את הטכניקה שלנו על ידי שקילת הדגים הראשון עם רשתות / סופג שיטה ואז שקילה מחדש את הדג לאחר שהוא מרדים, בעדינות מחק יבש. לא מצאנו הבדל משמעותי בין השיטות משקל (p = 0.7927, t-test). בנוסף, בדקנו אם זו הרשת / סופג הגלוקוז בדם מושפע השיטה, לעומת פשוט להעביר את הדגים כוס ברגע זה מרושת (לא סופג). לא מצאנו הבדל משמעותי ברמת הגלוקוז בדם בין שתי שיטות להעברת (p = 0.2241, t-test). הרדמה: הרדמה כימית מתאים מחקרים רבים. כאן יש לנו הפגינו הרדמה במים קרים כחלופה, כי הרדמה רבים (כולל tricaine/MS-222 (בראון, 1993)), להעלות את רמת הסוכר בדם. במחקרים קודמים, יש לנו מים קרים נקבע כי אין להעלות את רמת הסוכר בדם של דג הזברה (איימס et al. 2010). עבור הרדמה מים קרים, הטמפרטורה צריכה להיות ירד לאט. שיעור ירידה דומה תלוי בגודל של הדג, עם דגים קטנים הולך תחת מהר יותר מאשר דג גדול יותר. בעקבות הזרקה, ייתכן לצפות כי הדג הוא מחלים לאט מדי של חומר הרדמה (ראה להלן). זה יכול לגרום גם כאשר הטמפרטורה ההתחלתי הוא נמוך מדי, או כאשר הטמפרטורה יורדת מהר מדי. הטמפרטורה ההתחלתי הוא נמוך מדי אם מתכופף דגים רוחבית עם כניסתו למים. אם טמפרטורת המוצא היא נכונה, דגים יהיה לשמור על איזון שלה בתחילה. זה יהיה לסובב סנפירי החזה שלו למצב אופקי, התנשפות, יש תנועות operculum מהירה. בדרך כלל, זה יהיה לשחות. כאשר הטמפרטורה יורדת, תנועות יקטין ודגים יאבדו את שיווי המשקל. מטוס של הרדמה כירורגית הוא הגיע כאשר הדגים ניתן לטפל בלא להגיב. כדי לשמור על דגים תחת הרדמה כירורגית, האצבעות שלך חייב להיות קר, כדי לשמור אותם במים לפני הטיפול דגים. ספוג צריך גם להישמר בקירור בטמפרטורה זהה המים המשמשים הרדמה הדגים. חשוב להרוות את הספוג במים כי הוא sufficieקר ntly לשמור הרדמה פעם הדגים ממוקמת על זה. הזרקה: לפני זריקות התחייבות, מומלץ לנתח לפחות דג אחד כדי לקבל תחושה של עובי דופן הגוף. זה יכול לעזור לך לשפוט עד כמה המחט צריך להכניס להזין את חלל הבטן. בנוסף, כפי שאתה מכניס את המחט, אתה יכול להרגיש את הקיר הגוף &quot;לתת&quot; כאשר המחט חודר את חלל הבטן. במהלך הזריקה, לנקוט בצעדים כדי לשמור על החולה מאושר. ודא ספוג רווי מים קרים בטמפרטורה הנכונה כדי למנוע את הדגים להחיות במהלך ההזרקה. ספוג היטב רווי רך חשוב מזעור הנזק קשקשים וריר כיסוי של העור. ספוג היטב רווי חשוב גם לשמירה על הזימים סודה. אנו ממליצים בחום את הספוג קצף המפורטים להלן תחת חומרים. לבסוף, פעם הדג הוא הרדים, לעבוד במהירות כדי לצמצם את זמן הדג נמצא תחת. השחזור: הדג צריך להתאושש ההרדמה כמעט עם כניסתו מיכל מים חמים. אם הדג לא מתחיל מיד שחייה, בעדינות מערבולת המים לעבר הזימים שלו כדי להאיץ התאוששות. אם התאוששות איטית, אז הדג אל מתחת מהר מדי ואתה צריך להתאים את הליך ההרדמה כראוי. הסיבות האפשריות של התאוששות איטית נידונים תחת הרדמה.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Foam Sponge</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Jaece Industries</td>
<td>L800-D</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>60 mm Petri dish</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pipet tip box lid</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>not too deep, e.g. 1.5 cm</td>
</tr>
<tr>
<td>Plastic storage container</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>deep, e.g. 7 cm </td>
</tr>
<tr>
<td>Thermometer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Crushed ice</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>made from facility water</td>
</tr>
<tr>
<td>Warm facility water</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>1 liter or more</td>
</tr>
<tr>
<td>500 ml beaker</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>for weighing</td>
</tr>
<tr>
<td>NanoFil syringe</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>World Precision Instruments (WPI)</td>
<td>NANOFIL</td>
<td>or Hamilton syringe</td>
</tr>
<tr>
<td>35 gauge needle</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>NF35BV-2</td>
<td>beveled</td>
</tr>
<tr>
<td>Silflex tubing</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>SILFLEX-2</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>UltraMicroPump III and Micro4 controller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>UMPS-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Foot switch</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>WPI</td>
<td>15867</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Dissecting microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Plastic wrap</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Paper towels</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cortland salt solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

intraperitoneal injection into adult zebrafish

שיטה נוחה כימית בטיפול דג הזברה היא להציג מגיב למים טנק, איפה זה יהיה תפוס על ידי הדגים. עם זאת, שיטה זו מקשה לדעת כמה מגיב נספג או נלקח לכל הדגים. כמה שאלות ניסיוניות, במיוחד אלה הקשורים מחקרים מטבוליים, ניתן לפנות טוב יותר על ידי מתן כמות מוגדרת דגים כל, בהתבסס על המשקל. כאן אנו מציגים שיטה הזרקה (IP) intraperitoneal לתוך דג הזברה מבוגר. הזרקה היא לתוך חלל הבטן, אחורי אל חגורת האגן. הליך זה מותאם משיטות וטרינרי המשמש דגים גדולים יותר. זה בטוח, כפי שכבר ציין התמותה אפס. בנוסף, ראינו דימום במקום ההזרקה ב 5 מתוך 127 זריקות בלבד, ובכל אחד מהמקרים האלה הדימום היה קצר, שנמשך מספר שניות, וכמות הדם שאבד היה קטן. הצלחה עם הליך זה דורש טיפול עדין של הדג באמצעות מספר צעדים, כולל צום, שקילה, זריקת הרדמה, התאוששות. אמצעי זהירות נדרשים כדי למזער את הלחץ לאורך כל ההליך. אמצעי הזהירות שלנו כוללים שימוש נפח הזרקה קטן מחט 35G. אנו משתמשים בפתרון Cortland מלח כמו הרכב, אשר מאוזנת אוסמוטי של דגי מים מתוקים. אוורור של הזימים נשמר במהלך ההליך הזרקת ידי הראשון להביא את הדג לתוך מטוס כירורגית של הרדמה, אשר מאפשר תנועות operculum איטית, ושנית, על ידי החזקת דגים שוקת בתוך ספוג מים רוויים במהלך ההזרקה עצמה. אנו מדגימים את כלי ה-IP של הזרקת ידי הזרקת גלוקוז ניטור עלייה ברמת הגלוקוז בדם ולחזור הבאים שלה למצב נורמלי. כאשר הלחץ ידוע להגדיל הגלוקוז בדם בדגים teleost, אנו משווים את רמות הגלוקוז בדם אצל מבוגרים, הרכב מוזרק ולא מוזרק ולהראות כי ההליך אינו גורם לעלייה משמעותית רמת הסוכר בדם.

Watch this Scientific Journal Video about Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish at JoVE.com

Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

אנו מדגימים intraperitoneal הזרקה לתוך דג הזברה מבוגר. אנו משתמשים microsyringe 10 NanoFil μl נשלט על ידי בקר Micro4 ו UltraMicroPump III. הפגנה זו כוללת את השימוש במים קרים כחומר הרדמה.

הזרקה לתוך intraperitoneal דג הזברה למבוגרים

A convenient method for chemically treating zebrafish is to introduce the reagent into the tank water, where it will be taken up by the fish. However, ...

intraperitoneal-injection-into-adult-zebrafish

Research

JoVE Journal

Biology

56.8K Views.  The University of Chicago. אנו מדגימים intraperitoneal הזרקה לתוך דג הזברה מבוגר. אנו משתמשים microsyringe 10 NanoFil μl נשלט על ידי בקר Micro4 ו UltraMicroPump III. הפגנה זו כוללת את השימוש במים קרים כחומר הרדמה.

Video: Intraperitoneal Injection into Adult Zebrafish

Transplantation of Whole Kidney Marrow in Adult Zebrafish

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an organism. The functional definition of a HSC is a transplanted cell that has the ability to reconstitute all the blood lineages of an irradiated recipient long term. This designation was established by decades of seminal work in mammalian systems. Using hematopoietic cell transplantation (HCT) and reverse genetic manipulations in the mouse, the underlying regulatory factors of HSC biology are beginning to be unveiled, but are still largely under-explored. Recently, the zebrafish has emerged as a powerful genetic model to study vertebrate hematopoiesis. Establishing HCT in zebrafish will allow scientists to utilize the large-scale genetic and chemical screening methodologies available in zebrafish to reveal novel mechanisms underlying HSC regulation. In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish. We show the dissection and preparation of zebrafish whole kidney marrow, the site of adult hematopoiesis in the zebrafish, and the introduction of these donor cells into the circulation of irradiated recipient fish via intracardiac injection. Additionally, we describe the post-transplant care of fish in an "ICU" to increase their long-term health. In general, gentle care of the fish before, during, and after the transplant is critical to increase the number of fish that will survive more than one month following the procedure, which is essential for assessment of long term (&lt;3 month) engraftment. The experimental data used to establish this protocol will be published elsewhere. The establishment of this protocol will allow for the merger of large-scale zebrafish genetics and transplant biology.

In this article, we demonstrate a method to perform HCT in adult zebrafish.

השתלה של מח כליות שלמים דג הזברה למבוגרים

Hematopoietic stem cells (HSC) are a rare population of pluripotent cells that maintain all the differentiated blood lineages throughout the life of an ...

Injection of dsRNA into Female A. aegypti Mosquitos

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus.  The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes. This video protocol illustrates a method used by the James lab to inject dsRNA into female A. aegypti mosquitoes, which harbor the dengue virus. The technique for calibrating injection needles, manipulating the injection setup, and injecting dsRNA into the thorax is illustrated.

הזרקת dsRNA לתוך יתושים א נקבה aegypti

Reverse genetic approaches have proven extremely useful for determining  which genes underly resistance to vector pathogens in mosquitoes.  This video ...

Zebrafish Brain Ventricle Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved cavities within the brain that are filled with cerebrospinal fluid.  In zebrafish, after neural tube formation, the neuroepithelium undergoes a series of constrictions and folds while it fills with fluid resulting in brain ventricle formation.  In order to understand the process of ventricle formation, and the neuroepithelial shape changes that occur at the same time, we needed a way to visualize the ventricle space in comparison to the brain tissue.  However, the nature of transparent zebrafish embryos makes it difficult to differentiate the tissue from the ventricle space.  Therefore, we developed a brain ventricle injection technique where the ventricle space is filled with a fluorescent dye and imaged by brightfield and fluorescent microscopy.  The brightfield and the fluorescent images are then processed and superimposed in Photoshop.  This technique allows for visualization of the ventricle space with the fluorescent dye, in comparison to the shape of the neuroepithelium in the brightfield image.  Brain ventricle injection in zebrafish can be employed from 18 hours post fertilization through early larval stages.  We have used this technique extensively in our studies of brain ventricle formation and morphogenesis as well as in characterizing brain morphogenesis mutants (1-3).

After neural tube formation, the neuroepithelium constricts and folds while the tube fills with embryonic cerebrospinal fluid (eCSF) to form the embryonic brain ventricles. We developed this ventricle injection technique to better visualize the fluid filled space in contrast to the neuroepithelial shape in a live embryo.

החדר דג הזברה המוח Injection

Proper brain ventricle formation during embryonic brain development is required for normal brain function.  Brain ventricles are the highly conserved ...

Retro-orbital Injection in Adult Zebrafish

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is often the most effective and noninvasive form of delivery of an agent of interest. In the zebrafish (Danio rerio), IV injection of drugs has long been a challenge because of the small vessel diameter. This has also proved a significant hurdle for the injection of cells during hematopoeitic stem cell transplantation. Historically, injections into the bloodstream were done directly through the heart. However, this intra-cardiac procedure has a very high mortality rate as the heart is often punctured during injection leaving the fish prone to infection, massive blood loss or fatal organ damage. Drawing on our experience with the mouse, we have developed a new injection procedure in the zebrafish in which the injection site is behind the eye and into the retro-orbital venous sinus. This retro-orbital (RO) injection technique has been successfully employed in both the injection of drugs in the adult fish as well as transplantation of whole kidney marrow cells. RO injection has a much lower mortality rate than traditional intra-cardiac injection. Fish that are injected retro-orbitally tend to bleed less following injection and are at a much lower risk of injury to a major organ like the heart. Further, when performed properly, injected cells and/or drugs quickly enter the bloodstream allowing compounds to exert their effect on the whole fish and kidney cells to easily home to their niche. Thus, this new injection technique minimizes mortality while allowing efficient delivery of material into the bloodstream of adult fish. Here we exemplify this technique by retro-orbital injection of Tg(globin:GFP) cells into adult casper fish as well as injection of a red fluorescent dye (dextran, Texas Red ) into adult casper fish. We then visualize successful injections by whole animal fluorescence microscopy.

Here we show how to do retro-orbital injection in adult zebrafish.

רטרו מסלולית הזרקה של דג הזברה למבוגרים

Drug treatment of whole animals is an essential tool in any model system for pharmacological and chemical genetic studies. Intravenous (IV) injection is ...

Dissection of Organs from the Adult Zebrafish

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental analysis of the embryo and larva is extensive and the morphology has been well documented, descriptions of adult zebrafish anatomy and studies of development of the adult structures and organs, together with techniques for working with adults are lacking. The organs of the larva undergo significant changes in their overall structure, morphology, and anatomical location during the larval to adult transition.  Externally, the transparent larva develops its characteristic adult striped pigment pattern and paired pelvic fins, while internally, the organs undergo massive growth and remodeling.  In addition, the bipotential gonad primordium develops into either testis or ovary.  This protocol identifies many of the organs of the adult and demonstrates methods for dissection of the brain, gonads, gastrointestinal system, heart, and kidney of the adult zebrafish. The dissected organs can be used for in situ hybridization, immunohistochemistry, histology, RNA extraction, protein analysis, and other molecular techniques.  This protocol will assist in the broadening of studies in the zebrafish to include the remodeling of larval organs, the morphogenesis of organs specific to the adult and other investigations of the adult organ systems.

This protocol describes a procedure for identifying and dissecting organs from the adult zebrafish.

Dissection של איברים מן דג הזברה למבוגרים

Over the last 20 years, the zebrafish has become a powerful model organism for understanding vertebrate development and disease.  Although experimental ...

Direct Delivery of MIF Morpholinos Into the Zebrafish Otocyst by Injection and Electroporation Affects Inner Ear Development

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the eye, brain, and somites of zebrafish. The advantage of electroporation over other methods of genetic manipulation is that specific tissues can be targeted, both spatially and temporally, for the introduction of macromolecules by the application of electrical current. Here we describe the use of electroporation for transfecting mif and mif-like morpholinos into the tissues of the developing inner ear of the zebrafish. In past studies, mif morpholino injected into embryos at the 1- to 8-cell stage resulted in widespread morphological changes in the nervous system and eye, as well as the ear. By targeting the tissues of the inner ear at later stages in development, we can determine the primary effects of MIF in the developing inner ear, as opposed to secondary effects that may result from the influence of other tissues. By using phalloidin and acetylated tubulin staining to study the morphology of neurons, neuronal processes, and hair cells associated with the posterior macula, we were able to assess the efficacy of electroporation as a method for targeted transfection in the zebrafish inner ear. The otic vesicles of 24hpf embryos were injected with morpholinos and electroporated and were then compared to embryos that had received no treatment or had been only injected or electroporated. Embryos that were injected and electroporated showed a decrease in hair cell numbers, decreased innervation by the statoacoustic ganglion (SAG) and fewer SAG neurons compared with control groups. Our results showed that direct delivery of morpholinos into otocysts at later stages avoids the non-specific nervous system and neural crest effects of morpholinos delivered at the 1-8 cell stage. It also allows examination of effects that are directed to the inner ear and not secondary effects on the ear from primary effects on the brain, neural crest or periotic mesenchyme.

A method to deliver morpholinos directly into the zebrafish otocyst at 24hpf has been developed. Using microinjection of morpholinos into the lumen of otic vesicle and electroporation to effect penetration, we were able to bypass the effect of morpholinos on the brain and obtain effects specific to the inner ear.

משלוח ישיר של MIF Morpholinos Into Otocyst דג הזברה על ידי הזרקת electroporation משפיעה על פיתוח האוזן הפנימית

In recent years, electroporation has become a popular technique for in vivo transfection of DNA, RNA, and morpholinos into various tissues, including the ...

Transplantation of Cells Directly into the Kidney of Adult Zebrafish

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic diseases1. However, most organs are not easily accessible, necessitating the need to develop surgical methods to gain access to these structures. In this video article, we describe a method for transplanting cells directly into the kidney of adult zebrafish, a popular model to study regeneration and disease2. Recipient fish are pre-conditioned by irradiation to suppress the immune rejection of the injected cells3. We demonstrate how the head kidney can be exposed by a lateral incision in the flank of the fish, followed by the injection of cells directly in to the organ. Using fluorescently labeled whole kidney marrow cells comprising a mixed population of renal and hematopoietic precursors, we show that nephron progenitors can engraft and differentiate into new renal tissue - the gold standard of any cell-based regenerative therapy. This technique can be adapted to deliver purified stem or progenitor cells and/or small molecules to the kidney as well as other internal organs and further enhances the zebrafish as a versatile model to study regenerative medicine.

Cell transplantation is an essential technique for studying tissue regeneration and for developing cell-based therapies of disease. We demonstrate here a microsurgical technique that permits the transplantation of genetically labeled cells directly into the kidney of adult zebrafish fish.

השתלה של תאים ישירות לתוך הכליה של דג הזברה למבוגרים

Regenerative medicine based on the transplantation of stem or progenitor cells into damaged tissues has the potential to treat a wide range of chronic ...

Dissection of the Adult Zebrafish Kidney

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem cells during normal homeostasis and disease states. The understanding of adult stem cells has broad reaching implications for the future of regenerative medicine1. For example, better knowledge about adult stem cell biology can facilitate the design of therapeutic strategies in which organs are triggered to heal themselves or even the creation of methods for growing organs in vitro that can be transplanted into humans1. The zebrafish has become a powerful animal model for the study of vertebrate cell biology2. There has been extensive documentation and analysis of embryonic development in the zebrafish3. Only recently have scientists sought to document adult anatomy and surgical dissection techniques4, as there has been a progressive movement within the zebrafish community to broaden the applications of this research organism to adult studies. For example, there are expanding interests in using zebrafish to investigate the biology of adult stem cell populations and make sophisticated adult models of diseases such as cancer5. Historically, isolation of the zebrafish adult kidney has been instrumental for studying hematopoiesis, as the kidney is the anatomical location of blood cell production in fish6,7. The kidney is composed of nephron functional units found in arborized arrangements, surrounded by hematopoietic tissue that is dispersed throughout the intervening spaces. The hematopoietic component consists of hematopoietic stem cells (HSCs) and their progeny that inhabit the kidney until they terminally differentiate8. In addition, it is now appreciated that a group of renal stem/progenitor cells (RPCs) also inhabit the zebrafish kidney organ and enable both kidney regeneration and growth, as observed in other fish species9-11. In light of this new discovery, the zebrafish kidney is one organ that houses the location of two exciting opportunities for adult stem cell biology studies. It is clear that many outstanding questions could be well served with this experimental system. To encourage expansion of this field, it is beneficial to document detailed methods of visualizing and then isolating the adult zebrafish kidney organ. This protocol details our procedure for dissection of the adult kidney from both unfixed and fixed animals.
Dissection of the kidney organ can be used to isolate and characterize hematopoietic and renal stem cells and their offspring using established techniques such as histology, fluorescence activated cell sorting (FACS)11,12, expression profiling13,14, and transplantation11,15. 
We hope that dissemination of this protocol will provide researchers with the knowledge to implement broader use of zebrafish studies that ultimately can be translated for human application.

The zebrafish kidney is home to both renal and hematopoietic adult stem/progenitor cells, and represents an outstanding opportunity to study these cell types and their progeny in a vertebrate model organism. Here, we demonstrate a detailed dissection procedure that enables the researcher to identify and surgically remove the adult zebrafish kidney, which can be used for applications such as cell isolation, transplantation, and expression studies of kidney and/or blood cell populations.

Dissection של הכליה דג הזברה למבוגרים

Researchers working in the burgeoning field of adult stem cell biology seek to understand the signals that regulate the behavior and function of stem ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal neurons. In contrast, the adult zebrafish retina possesses the robust ability to spontaneously regenerate any neuronal class that is lost in a variety of different retinal damage models, including retinal puncture, chemical ablation, concentrated high temperature, and intense light treatment 1-8. Our lab extensively characterized regeneration of photoreceptors following constant intense light treatment and inner retinal neurons after intravitreal ouabain injection 2, 5, 9. In all cases, resident M&uuml;ller glia re-enter the cell cycle to produce neuronal progenitors, which continue to proliferate and migrate to the proper retinal layer, where they differentiate into the deficient neurons. 
	We characterized five different stages during regeneration of the light-damaged retina that were highlighted by specific cellular responses. We identified several differentially expressed genes at each stage of retinal regeneration by mRNA microarray analysis 10. Many of these genes are also critical for ocular development. To test the role of each candidate gene/protein during retinal regeneration, we needed to develop a method to conditionally limit the expression of a candidate protein only at times during regeneration of the adult retina. 
	Morpholino oligos are widely used to study loss of function of specific proteins during the development of zebrafish, Xenopus, chick, mouse, and tumors in human xenografts 11-14. These modified oligos basepair with complementary RNA sequence to either block the splicing or translation of the target RNA. Morpholinos are stable in the cell and can eliminate or "knockdown" protein expression for three to five days 12. 
	Here, we describe a method to efficiently knockdown target protein expression in the adult zebrafish retina. This method employs lissamine-tagged antisense morpholinos that are injected into the vitreous of the adult zebrafish eye. Using electrode forceps, the morpholino is then electroporated into all the cell types of the dorsal and central retina. Lissamine provides the charge on the morpholino for electroporation and can be visualized to assess the presence of the morpholino in the retinal cells. 
	Conditional knockdown in the retina can be used to examine the role of specific proteins at different times during regeneration. Additionally, this approach can be used to study the role of specific proteins in the undamaged retina, in such processes as visual transduction and visual processing in second order neurons.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Adult Zebrafish Retina

A method to conditionally knockdown a target protein&#x2019;s expression in the adult zebrafish retina is described, which involves intravitreally injecting antisense morpholinos and electroporating them into the retina. The resulting protein is knocked down for several days, which allows testing the protein&#x2019;s role in the regenerating or intact retina.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך הרשתית דג הזברה למבוגרים

Many devastating inherited eye diseases result in progressive and irreversible blindness because humans cannot regenerate dying or diseased retinal ...

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration of adult tissues, such as the heart1, retina2, spinal cord3, optic nerve4, sensory hair cells5, and fins6.
The zebrafish fin is a relatively simple appendage that is easily manipulated to study multiple stages in epimorphic regeneration. Classically, fin regeneration was characterized by three distinct stages: wound healing, blastema formation, and fin outgrowth. After amputating part of the fin, the surrounding epithelium proliferates and migrates over the wound. At 33 &deg;C, this process occurs within six hours post-amputation (hpa, Figure 1B)6,7. Next, underlying cells from different lineages (ex. bone, blood, glia, fibroblast) re-enter the cell cycle to form a proliferative blastema, while the overlying epidermis continues to proliferate (Figure 1D)8. Outgrowth occurs as cells proximal to the blastema re-differentiate into their respective lineages to form new tissue (Figure 1E)8. Depending on the level of the amputation, full regeneration is completed in a week to a month.
The expression of a large number of gene families, including wnt, hox, fgf, msx, retinoic acid, shh, notch, bmp, and activin-betaA genes, is up-regulated during specific stages of fin regeneration9-16. However, the roles of these genes and their encoded proteins during regeneration have been difficult to assess, unless a specific inhibitor for the protein exists13, a temperature-sensitive mutant exists or a transgenic animal (either overexpressing the wild-type protein or a dominant-negative protein) was generated7,12. We developed a reverse genetic technique to quickly and easily test the function of any gene during fin regeneration.
Morpholino oligonucleotides are widely used to study loss of specific proteins during zebrafish, Xenopus, chick, and mouse development17-19. Morpholinos basepair with a complementary RNA sequence to either block pre-mRNA splicing or mRNA translation. We describe a method to efficiently introduce fluorescein-tagged antisense morpholinos into regenerating zebrafish fins to knockdown expression of the target protein. The morpholino is micro-injected into each blastema of the regenerating zebrafish tail fin and electroporated into the surrounding cells. Fluorescein provides the charge to electroporate the morpholino and to visualize the morpholino in the fin tissue.
This protocol permits conditional protein knockdown to examine the role of specific proteins during regenerative fin outgrowth. In the Discussion, we describe how this approach can be adapted to study the role of specific proteins during wound healing or blastema formation, as well as a potential marker of cell migration during blastema formation.

In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin

We describe a method to conditionally knockdown the expression of a target protein during adult zebrafish fin regeneration. This technique involves micro-injecting and electroporating antisense oligonucleotide morpholinos into fin tissue, which allows testing the protein&#x2019;s role in various stages of fin regeneration, including wound healing, blastema formation, and regenerative outgrowth.

ב electroporation vivo של Morpholinos לתוך למבוגרים התחדשות זנב סנפיר דג הזברה

Certain species of urodeles and teleost fish can regenerate their tissues. Zebrafish have become a widely used model to study the spontaneous regeneration ...