עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (NCI R00 CA132784) לKT

1. בידוד של תאי mononuclear מדם טבורים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן EDTA-PBS חיץ להוסיף 5 מיליליטר פתרון שור אלבומין (BSA) מלאה לחיץ שטיפת מ&quot;ל 95 (1:20 דילול). דגת חיץ ולשמור על החיץ על קרח. החשוב: אי דגת המאגר עלול לגרום לפחות מתוצאות אופטימליות כאשר בידוד CD19 + תאי B בגלל בועות עלולות לחסום את טור הבידוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50 צינורות חרוטי מ&quot;ל לצנטריפוגה שיפוע הצפיפות. לקבוע את מספר הצינורות הנדרשים לעיבוד דם הטבורים (צינור 1 יכול לעבד דם מ&quot;ל 8) ומוסיף 15 מ&quot;ל של PLUS Ficoll-Paque לכל צינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דלל 8 מ&quot;ל של דם טבורים עם 24 המ&quot;ל DPBS (1X) ושכבה בזהירות את תערובת דם הטבורים המדוללת על גבי PLUS Ficoll-Paque בכל אחד מצינורות חרוטי 50 המ&quot;ל. אין לערבב את הדם וPLUS Ficoll-Paque. חשוב: כדי להימנע מערבוב של דם הטבורים וPLUS Ficoll-Paque, מחזיק את הצינור בזווית של 45 מעלות ושכבת תערובת הדם באיטיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה XG ב 400 במשך 40 דקות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס תאי mononuclear (MNC) יישארו ב- Ficoll-Paque פלזמת PLUS ממשק אילו גרנולוציטים ואריתרוציטים משקעים עקב צפיפות גבוהה יותר בלחץ האוסמוטי של Ficoll-Paque PLUS. תווית 7 5 צינורות מיליליטר ישבן עגול שישמשו בחלק 3 עם מדגם הזהות, התאריך והבא: </li></ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שפופרת </td><td> מדבקה </td><td> מטרה </td></tr><tr><td> 1 </td><td> בתוליים </td><td> תאי בתוליים לנורמליזציה במהלך הזרימה cytometry </td></tr><tr><td> 2 </td><td> 7AAD </td><td> כדי לקבוע כדאיות במהלך הזרימה cytometry </td></tr><tr><td> 3 </td><td> + + + </td><td> מכיל את התאים שיסודרו </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 34 + </td><td> לאסוף CD34 + / CD19 +(מאוחר פרו-B - מוקדם מראש BI) תאים </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 45 נמוכים </td><td> לאסוף CD34 - / CD19 + / CD45 הנמוך (טרום BI) תאים </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 45 מד </td><td> לאסוף CD34 - / CD19 + / CD45 (לפני BII) תאי med </td></tr><tr><td> 7 </td><td> 45 גבוהים </td><td> לאסוף CD34 - / CD19 + / CD45 גבוה (B) תאים לא בשלים </td></tr></tbody></table> מעייל צינורות 4, 5, 6, 7 ועם 2% FBS ולמקם את כל הצינורות על קרח. <ol start="5" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב את השכבה העליונה בזהירות הפלזמה ולהימנע ממגע עם שכבת תא mononuclear. באמצעות 10 מיליליטר זכוכית פיפטה, להעביר את שכבת תא mononuclear זהירות לצינור חרוטי מ&quot;ל חדש 50. שלב את תאי mononuclear משלושה צינורות יחד לתוך צינור מ&quot;ל אחת 50. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את הצינור עם PBS, מערבב בעדינות וסרכזת ב 300 XG עבור 10 דקות ב20 ° C. בזהירות לשאוב supernatant מבלי להפריע לתא הגלול. חזור על 1x. לאחר השטיפה הראשונה, resuspend את הכדורים ולהעביר לצינור מיליליטר חרוטי 50 אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עדינות resuspend התא גלול ב 200 μl של PBS. הסר μl 1 להשעית התא, להוסיף אותו ל1 מ&quot;ל של PBS בצינור microcentrifuge מ&quot;ל 1.5 ומניח בצד לספירה (ספירת תאים לאחר ביצוע השעית התא 50 המ&quot;ל בצנטריפוגה). מלא את הצינור עם PBS וסרכזת ב 200 XG במשך 15 דקות כדי להסיר הטסיות. הסר את supernatant לחלוטין מבלי להפריע לתא הגלול. </li></ol> 2. בידוד תא B שונה מתאי mononuclear באמצעות הפרדת MACS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend הגלולה מצעד 1.7 עם קור μl 160 (4 מעלות צלזיוס) חיץ EDTA-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 40 קוקטייל נוגדני μl B-CLL ביוטין. פיפטה לערבב היטב ודגירה במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים - להוסיף 1 מ&quot;ל קר (4 ° C) חיץ EDTA-PBS לכל 10 מיליון תאים (תאים נוmber קבע בשלב 1.7) וסרכזת ב 300 XG למשך 10 דקות. לשאוב supernatant לחלוטין ואז resuspend התא גלול ב קר μl 320 (4 מעלות צלזיוס) חיץ EDTA-PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 80 microbeads μl אנטי ביוטין, מערבב היטב ודגירה במשך 15 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף תאים - להוסיף 1 מ&quot;ל קר (4 ° C) חיץ EDTA-PBS לכל 10 מיליון תאים וצנטריפוגות XG בטמפרטורה של 300 למשך 10 דקות. Resuspend עד 100 מיליון תאים ב500 μl של קר (4 ° C) חיץ EDTA-PBS. נפח חיץ בקנה מידה בהתאם למספר תא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן עמודות מקים ומפרידי מקים בצנטריפוגה (שלב 2.5). הנח עמודת LS בשדה המגנטי של מפריד MACS, להוסיף 3 מ&quot;ל של קר (4 ° C) חיץ EDTA-PBS על העמודה ולאפשר החיץ לטפטף דרך העמודה. השתמש בכלי קיבול לתפוס את הזרימה דרכו. השלך את הזרימה דרכו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח צינור חרוטים 50 מ&quot;ל מתחת לעמודה ופיפטה השעית התא על העמודה. לאפשר את התאים ללא תווית לטפטף through העמודה ולתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל. חשוב: אלו הם תאים שישמשו לתיוג נוגדן ומיון תא. אל תמחק את הזרימה דרכו. כדי לשחזר את כל התאים מצעד 2.5, להוסיף מ&quot;ל נוסף של 1 קר (4 ° C) החיץ EDTA-PBS לקירות צינור החרוטים. מערבב בעדינות ופיפטה השעית התא שנותר על העמודה. חזור על 1x. המשך לשלב 2.8 שימוש בתאים ללא תווית שנאספו בצינור החרוטים לאחר שעבר דרך העמודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא את צינור החרוטים המכילים תאים ללא תווית עם PBS וצנטריפוגה XG ב 300 למשך 10 דקות. הסר בזהירות את supernatant מבלי להפריע לתא הגלול. הוסיפו 200 μl של חיץ EDTA-PBS ועדינות resuspend התאים. </li></ol> 3. תיוג נוגדן והכנה למיון תא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב μl 1 להשעית התא והמקום לצינור כותרתו &quot;כתם&quot; (שלב 1.4). הוסף 500 חיץ μl EDTA-PBS ולאחסן את הצינור על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20μl של כל נוגדן (CD19, CD34 ו CD45) למיליון תאים לתוך השעית התא הנותרת. מערבב היטב ומניח את השפופרת בחושך למשך 30 דקות ב RT. נוגדני CD הם צעדים רגישים לאור, להשלים 2-4 עם האורות כבויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 30 דקות של דגירה עם נוגדנים, לשאוב 40 μl של השעית התא ולמקם אותו לתוך הצינור שכותרתו &quot;7AAD&quot;. הוסף 1 המ&quot;ל PBS לתוך הצינור וצנטריפוגה XG ב 500 במשך 2 דקות. הסר את supernatant ו resuspend התאים ב100 μl של חיץ מחייב. הוסף 7 μl של 7AAD (7-Aminoactinomycin D) ודגירה בחושך למשך 10 דקות בRT. במהלך שלב דגירת 10 דקות המלאה 3.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף PBS לראש של הצינור המכיל את התאים הנותרים שכותרתו עם נוגדני CD. צנטריפוגה הצינור ב 500 XG ל3 דקות. הסר את supernatant, להוסיף 500 μl EDTA-PBS חיץ וresuspend התא הגלול. להעביר את כל הנפח של השעית התא לתוך הצינור שכותרתו &quot;+ + +&quot;. כדי לשחזר את כל השעית התאdd 1 חיץ נוסף מ&quot;ל EDTA-PBS לצינור 50 מיליליטר חרוטים והעברה לתוך צינור כותרתו &quot;+ + +&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה (שלב 3.3), להוסיף חיץ מחייב 300 μl לתוך צינור 7AAD. &quot;כתם&quot;, &quot;7AAD&quot; ו &quot;+ + +&quot; דגימות ו&quot; 34 + &quot;,&quot; 45 נמוכים &quot;,&quot; 45 מד &quot;ו&quot; 45 &quot;גבוהים צינורות מוכנים לcytometry זרימה. </li></ol> 4. מיון נייד באמצעות Cytometer התזרים XDP MoFlo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת MoFlo למיון: יישור לייזרים; לייצב זרם אגל; לקבוע עיכוב ירידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פקדי פיצויי צבע אחד באמצעות Invitrogen ABC עכבר חרוז ערכה (או דומה) על פי הוראות היצרן. הפעלת פקדי צבע אחד, כדי להתאים את המתחים של ערוצי קרינה להפרדה אופטימלית של אוכלוסיות חיוביות ושליליות. הגדר מקדמי פיצויים ולהחיל פרמטר פיצוי לפרוטוקול אוסף. להקים מחדש מקדמי פיצויים בכל פעם הרבה חדש של נוגדן מתקבל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יצירת פרוטוקול כולל חלקות כפי שמוצג באיור 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מדגם כתם, להגדיר מתח ורווח לפיזור קדימה וצד, ולזהות אוכלוסיות קרינה שליליות. בגלל התאוששות הדנ&quot;א היא המטרה של המיון, הסף צריך להיות מוגדר נמוך (≤% 1), כך שפסולת דנ&quot;א המכיל לא לזהם את הדגימות שנאספו. * ודא שמערכת פינוי התרסיס פועלת בכל העת שגרות תאים אנושיים מתנהלים בMoFlo. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל aliquot קטן של + + + מדגם (~ 50,000 אירועים) להגדיר את אסטרטגית gating (איור 2). בגלל אבות B-cell לא פיזור זהה להתבגר תאי B, backgate CD19 + ungated / CD34 + אוכלוסייה על עלילת SSC vs FSC כדי להבטיח את שער הלימפוציטים כולל תאים פוטנציאליים Pro-B. מתוך מדגם זה גם להגדיר את אוכלוסיית פלואורסצנטי השלילית ל7AAD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את מדגם 7AAD כדי לקבוע כדאיות מדגם. רק תאים למיין במדגם עם כדאיויות גבוהות במלכתחילה (≥ 95%) כתאים מתים יהיה כתם ללא הבחנה ועלול לזהם אוכלוסיות מיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את החלטות מיון לאסוף 4 אוכלוסיות: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 נמוך; CD19 + / CD34 - / CD45 מד; וCD19 + / CD34 - / CD45 גבוה. כלול את הלימפוציטים ושערי אפלית מקטורן בהחלטות המיון של כל האוכלוסיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למנוע סתימות בקצה המיון, סינון + + + מדגם דרך מסננת תא 40 מיקרומטר מייד לפני המיון והסינון מחדש אם בכלל צבירה מתרחשת במדגם במהלך מיון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיין את התאים לתוך צינורות איסוף (שלב 1.4) מצופים 2% FBS ב PBS בבעל צינור מקורר או קרח וגדוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לאחר המיון יושלם, לחלץ דנ&quot;א. </li></ol>

<ol>
	<li>Song, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+tissue-specific+differentially+methylated+regions+(TDMs)+with+differential+gene+expression.">Association of tissue-specific differentially methylated regions (TDMs) with differential gene expression.</a> PNAS. 102 (9), 3336-3341 (2005).</li><li>Ohgane, J., Yagi, S., Shiota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetics:+The+DNA+methylation+profile+of+tissue-dependent+and+differentially+methylated+regions+in+cells.">Epigenetics: The DNA methylation profile of tissue-dependent and differentially methylated regions in cells.</a> Placenta. 29 (S), 29-35 (2008).</li><li>Brown, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sequential+determination+model+of+hematopoiesis.">The sequential determination model of hematopoiesis.</a> Trends Immunol. 28 (10), 442-448 (2007).</li><li>Clark, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lymphocyte+subsets+in+normal+bone+marrow.">Lymphocyte subsets in normal bone marrow.</a> Blood. 67 (6), 1600-1606 (1986).</li><li>Loken, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+human+bone+marrow.+II.+Normal+B+lymphocyte+development.">Flow cytometric analysis of human bone marrow. II. Normal B lymphocyte development.</a> Blood. 70 (5), 1316-1324 (1987).</li><li>Caldwell, C. W., Poje, E., Helikson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=B-cell+precursors+in+normal+pediatric+bone+marrow.">B-cell precursors in normal pediatric bone marrow.</a> American Journal of Clinical Pathology. 95 (6), 816-823 (1991).</li><li>Tucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Are+cord+blood+B+cells+functionally+mature?.">Are cord blood B cells functionally mature?.</a> Clin. Exp. Immunol. 84 (3), 389-394 (1991).</li><li>Ghia, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ordering+of+human+bone+marrow+B+lymphocyte+precursors+by+single-cell+polymerase+chain+reaction+analyses+of+the+rearrangement+status+of+the+immunoglobulin+H+and+L+chain+gene+loci.">Ordering of human bone marrow B lymphocyte precursors by single-cell polymerase chain reaction analyses of the rearrangement status of the immunoglobulin H and L chain gene loci.</a> J. Exp. Med. 184, 2217-2219 (1996).</li><li>Noordzij, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+of+precursor+B-cell+compartment+in+bone+marrow+from+patients+with+X-linked+agammaglobulinemia+compared+with+healthy+children.">Composition of precursor B-cell compartment in bone marrow from patients with X-linked agammaglobulinemia compared with healthy children.</a> Pediatric Research. 51 (2), 159-168 (2002).</li><li>van Zelm, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ig+gene+rearrangement+steps+are+initiated+in+early+human+precursor+B+cell+subsets+and+correlate+with+specific+transcription+factor+expression.">Ig gene rearrangement steps are initiated in early human precursor B cell subsets and correlate with specific transcription factor expression.</a> J. Immunol. 175 (9), 5912-5922 (2005).</li><li>Rauch, T. A., Pfeifer, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MIRA+method+for+DNA+methylation+analysis.">The MIRA method for DNA methylation analysis.</a> Methods Mol. Biol. 507, 65-75 (2009).</li><li>Kanof, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+whole+mononuclear+cells+from+peripheral+blood+and+cord+blood.">Isolation of whole mononuclear cells from peripheral blood and cord blood.</a> Current Protocols in Immunology. , 7.1.1-7.1.7 (1996).</li><li>LeBien, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fates+of+human+B-cell+precursors.">Fates of human B-cell precursors.</a> Blood. 96 (1), 9-23 (2000).</li><li>Schmid, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=International+society+for+analytical+cytology+biosafety+standard+for+sorting+of+unfixed+cells.">International society for analytical cytology biosafety standard for sorting of unfixed cells.</a> Cytometry A. 71 (6), 414-437 (2007).</li><li>Malaspina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Appearance+of+immature/transitional+B+cells+in+HIV-infected+individuals+with+advanced+disease:+correlation+with+increased+IL-7.">Appearance of immature/transitional B cells in HIV-infected individuals with advanced disease: correlation with increased IL-7.</a> PNAS. 103 (7), 2262-2267 (2006).</li></ol>

סופרים אין לי מה לחשוף.

הגורם בעל ההשפעה הגדולה ביותר על הצלחתו של הפרוטוקול הוא הנוכחות של זיהום פסולת. אם מבקש דם מבנק דם טבורים חשוב לי הדם נשלח מייד לאחר גבייה ככל האפשר. בנוסף, דגימות שסווגו כlymphocytosis להכיל מספרים גבוהים יותר של לימפוציטים, אך הדגימות הללו אין מספרים מספיקים של מבשר תאי B ולא צריך להיות בשימוש. כדי להגדיל את ההסתברות לקבלת כמות מספקת של תאים לכל אחת מקבוצות המשנה המבשר אנו ממליצים מתחילים עם לפחות 85 מ&quot;ל של דם טבורים. חשוב לציין כי בניגוד להפרדות דם היקפיות בוגרות, כאשר fractionating דם טבורי שכבת mononuclear לעתים קרובות מזוהמת בתאי דם אדומים 12. פרוטוקול זה כולל שטיפת צעד נוסף כדי להסיר טסיות מזהמות. פרוטוקולים מתארים הפרדות mononuclear מדם הטבורי מציעים כולל לא צעד תמוגהo להסיר תאים אדומים לא רצויים. אנו לא ממליצים על הצעד הזה, כי זה מייצר פסולת מזהמת ויש לו השפעה שלילית על ההצלחה של סוג התא. על מנת להקטין את מספר התאים שצריכים להיות מכובדים על ידי הזרימה cytometry יש צורך לבצע העשרת תא B לפני מיון תא. הפרוטוקול המסופק על ידי Miltenyi BIOTEC, המלווה את ערכת בידוד תא B (B-CLL), כבר מותאם לדם היקפי וממליץ להשתמש 10 קוקטייל μl B-CLL ביוטין נוגדן לכל 10 מיליון תאים. צעד זה נעשה שימוש בנוגדנים נגד CD2 (תאי T, תאי NK), CD4 (תאי T), CD11b (גרנולוציטים; מונוציטים; מקרופגים), CD16 (תאי NK; מקרופגים; תאי פיטום), CD36 (טסיות דם), CD235a (תאי erythroid) כדי לרוקן את התאים שאינם B מדם חבל הטבור. חשוב להשתמש בערכה שתוארה ולא ב-צינוק הערכה השנייה כי הערכה לשעבר מכילה נוגדנים נגד CD43 אשר שוהים בתאים פרו-B. במהלך אופtimization של פרוטוקול זה, מצא כי סכום כולל של 40 μl של קוקטייל נוגדני ביוטין B-CLL הוא מספיק כדי לייצר תוצאת סוג תא חיובית. בנוסף מצאנו כי שימוש μl קטן כמו 5 יותר מקוקטייל נוגדני ביוטין B-CLL היו השפעות שליליות על סוג התא. לכן, מומלץ מאוד להשתמש ב 40 μl של קוקטייל נוגדני ביוטין B-CLL למספרים סלולריים mononuclear כלל בין 175-250000000. אם מתחיל עם מספרים נמוכים יותר או גבוהים יותר של תאים ייתכן שיהיה צורך להרחיב את ריאגנטים בהתאם. יש פרסומים סותרים רבים המתארים את הסמנים שיכולים לשמש כדי להבדיל תת אוכלוסיות של תאי B. רוב הפער יכול להיות מוסבר על ידי העובדה שבידול הוא תהליך מתמשך, וכי נוכחותו או היעדריו של סמנים בתא שטח מתרחשת באופן הדרגתי ולא באופן הכל או לא כלום. בפרוטוקול זה CD34 - / CD19 + ורמת האינטנסיביות של CD45 + (ביטוי נמוך, בינוני, גבוה) שמש להבחין מראש BI, B-תאים טרום BII ובוגרים עם עלייה ברמה של CD45 ביטוי מקביל להתקדמות של בידול 6. תאי Pro-B כבר תואר על ידי כמה להיות CD19 + / CD34 + 13 בעוד שאחרים הראו כי תאים פרו-B CD19 - / CD34 + ותאים טרום BI הם CD19 + / CD34 + 9,10. בהתבסס על פערים אלה יש לנו מיועדים לCD19 + / CD34 + תאים כמו תאים פרו-B מאוחרים / תאים מוקדמים מראש BI. חשוב לציין כי אסטרטגיה זו פותחה לבודד תת קבוצות של מבשר תאי B המתאים לתאים המושפעים מלוקמיה לימפובלסטית המחלה החריפה. עם זאת, ישנן אסטרטגיות מיון מרובות שעשויה להיות מועסק בהתאם לתת סוג התא של עניין. שילובי נוגדנים fluorochrome צריכים להיות נבחר על סמך היכולות של סדרן התא הזמין. כgeneraאני ככלל, fluorochrome הבהיר ביותר בלוח שלך יש להשתמש כדי לתייג את האנטיגן לפחות מאוכלס, ולהיפך. באיתור אוכלוסיות כפולות מוכתמות, במיוחד אירועים נדירים כגון אלה, אפלית כפיל (האיור 2B) היא חלק חשוב ביותר של אסטרטגית gating. הדבר מבטיח כי אירועים כפולים חיוביים הם באמת תאים בודדים מגואלים בשני נוגדנים ולא רק שני תאים בודדים מוכתמים דבקו זה לזה. מהירות גבוהה, מיון תא 4-way בהכרח יוצרת סביבת אירוסול מבוקרת. לכן, מיון תא אנושי חי צריך להתבצע בזהירות רבה. פורסמו הנחיות בטיחות וטיהור זמינות ויש לבחון וליישם לפני הסוג 14. אישור מועדות biosafety מוסדיות או מקביליהם ייתכן שיידרש קודם למיון. לטיהור נאותה לאחר מיון, אקונומיקה, יש להוסיף למכל הפסולת לריכוז סופי של 10%. סיmilarly, כל צינורות דגימות, כמו גם את כל המשטחים בסביבה הקרובה יש לטהר ביסודיות עם 10% תמיסת כלור טרי. לסיכום, פרוטוקול זה מספק אסטרטגיה להשגת אוכלוסיות נדירות של מבשר תאי B וניתן לשנותו לבודד אוכלוסייה נוכחת בדם טבורים כוללים תאי גזע hematopoietic ובשל תאי T נדיר. לאחרונה, תאי B בשלים זוהו בדם ההיקפי של אנשים עם מתקדם 15-HIV. לפיכך, התועלת שבשיטה זו מאריכה מעבר למחקר של סרטן הדם. לבסוף, יש לנו עדיין לא בצעו בידודי RNA בתאים הממוינים הזרימה, אך שיטה זו צריכה להיות התאמה שיש לשים לב כי בתא מיון התאים אמורים להיות מיון ישירות לתוך trizol או פתרון תואם מקביל RNA כגון RLT מערכת RNeasy זמין דרך Qiagen.

על מנת לזהות את הסטיות שנמצאות במחלה, חשוב וחיוני שאנו משתמשים רקמות או תאים שמתאימים לסוג הרקמה או תא המושפע מהמחלה בריאות. אחת סיבות לכך היא שוריאצית epigenetic בין סוגי רקמות היא אחראית לויסות התבטאות של גנים שהן קריטי להתמיינות תאים במהלך ההתפתחות האנושית 1,2 הנורמלי. סיבה שנייה היא שהרגולציה של הגנים ספציפית החריגה הרקמה עלולה להיות השלכות חמורות על התפתחות נורמלית וידועה לתרום למספר רב של מצבי מחלה, כוללים סרטן. לכן, הבנה טובה יותר של מחלה המערבת תאי hematopoietic דורשת ידע בתאי hematopoietic בריאים. הפיתוח של תאי hematopoietic בתמורת מח העצם באמצעות סדר שיטתי של אירועים המתאפיינים בשינויים בביטוי של סמנים פני תא 3. מחקרים שכלל משתתף מבוגרים ישהראה כי מוח עצם מכיל בדרך כלל מספר נמוך של מבשר תאי B 4,5, ואילו מחקרים שכלל ילדי משתתפים הראו כי אחוז מבשר תאי B הוא גבוה יחסית אצל אנשים פחות מ 5 שנים של גיל 6. דם חבל טבור משמש כמקור לתאי גזע hematopoietic בטיפול בהפרעות ומחלות ממאירות הקשורות בדם, הוא זמין דרך בנקי דם טבורים ומועשר לB לא בוגר ותאי T 7 שהם תאי המטרה של הפרעות רבות, כולל לוקמיה ו לימפומה. מבשר תאי B במח העצם כבר phenotyped הרחבת 8,9 ויכול להיות מוגדר על ידי הנוכחות של סמנים בתא שטח ספציפיים שניתן להשתמש בם כדי למיין תאים אלה לקבוצות משנה נפרדות. תמורה נורמלית B-cell בידול באמצעות סדרה של שלבים במח העצם, החלו בתאים המוקדמים פרו-B וכלה בתאי B בשלים או נאיביים. פיולאן Zelm ועמיתים 10, תאים פרו-B מאופיינים על ידי הנוכחות של CD34 ובמעבר לשלב 2 (Pre-BI) CD19 נרכש. שלב 3 (Pre-BII) תאים אינם מפורשים CD34 ולהתחיל לבטא IgM cytoplasmic. לבסוף, מאפיין בולט של שלב 4 (לא בוגר תאי B) הוא הביטוי של IgM פני שטח. אסטרטגית המיון המתואר בפרוטוקול זה תואר לראשונה על ידי קאלדוול ועמיתים 6 וכוללת את השימוש של רק 3 סמנים בתא שטח אשר מקטינים מאוד את המורכבות והעלות של ביצוע ניסויי מיון תא. בעבודתם, יחסים בין CD45 ושלבי התמיינות תא B הוקמו. הם הבחינו כי B-תאים במח עצם הצגת רמות משתנות של ביטוי של CD45. באופן ספציפי, תאים שהביעו רמות גבוהות של CD45 התכתבו לתאים המבטאים את IgM משטח (-B תאים לא בשלים), אלה שהביעו רמה בינונית של CD45 התכתבו לתאים שהביעו cytoplasmic IgM (תאים טרום BII), ואלה שהביעו רמות נמוכות של CD45 התכתב לתאים שלא מבטאים IgM cytoplasmic (תאים טרום BI). פרוטוקול זה משתמש באסטרטגיה שפותחה על ידי קאלדוול ועמיתים 6 לבודד תת קבוצות של מבשר תאי B מדם הטבורי (איור 1) אשר ניתן להשתמש במבחנים הדורשים זרם חומצות גרעין באיכות גבוהה כגון assay התאוששות האי מפוגל-CPG (מירה ) 11 ומבחנים PCR כמותיים בזמן אמת. השיטה מעסיקה הפרדה ראשונית באמצעות חרוזים מגנטיים לרוקן את כל התאים שאינם B מדם חבל טבור ודורשת הכתמה עם רק 3 נוגדנים (CD34, CD19 וCD45). התאים שהם התאוששו מייצגים 4 שלבי התמיינות תא B: 1) CD34 +; CD19 + (מאוחר פרו B-ובתחילה מראש BI), 2) CD34 -; CD19 +; CD45 הנמוך (מאוחר מראש BI); 3) CD34 -; CD19 +; CD45 מד (לפני BII); ו4) CD34 -; CD19 +; CD45 גבוה (לא בשל תאי B).

<table border="1">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of Reagent/Material</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS (1X)</td>
			<td>Gibco by Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ficoll-Paque PLUS</td>
			<td>GE Healthcare Bio-Sciences AB</td>
			<td>17-1440-03</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LS Column</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-401</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS Multi Stand</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-303</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MidiMACS Separator</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-042-302</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>B-Cell Isolation Kit (B CLL)</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-093-660</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>ATLANTA Biologicals</td>
			<td>S11195</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube (1.5 ml)</td>
			<td>MIDSCI</td>
			<td>SS1500</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Pharmingen 7-AAD (7-Aminoactinomycin D)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>559763</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB Pharmingen APC Mouse Anti-Human CD19</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>555415</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DB Pharmingen PE Mouse Anti-Human CD34</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>560941</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 FITC</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347463</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>autoMACS Rinsing Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-222</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MACS BSA Stock Solution</td>
			<td>MACS Miltenyi Biotec</td>
			<td>130-091-376</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 5 ml Polystyrene Round-Bottom Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352058</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon 50 ml Tube</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352098</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PuraFlow Sheath Fluid, 8X</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>CY30230</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FlowCheck Alignment beads</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>6605359</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultra Rainbow Alignment beads</td>
			<td>Spherotech</td>
			<td>URFP-30-2</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ViroSafe Aerosol Evacuation Filter</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>ML01330</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ABC Mouse bead kit</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-10344</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 &mu;m cell strainer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>22363547</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisher Scientific Hemocytometer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>267110</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>accuSpin Model 3R Benchtop Centrifuge</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-100-516</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MoFlo XDP flow Cytometer</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>ML99030</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aerosol Evacuation Unit</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of precursor b-cell subsets from umbilical cord blood

דם חבל טבור מועשר לתאי אבות היווצרות דם בשלבי מחויבות שושלת שונים. פתחנו פרוטוקול לבידוד מבשר תאי B בארבעה שלבים שונים של בידול. בגלל גנים בא לידי ביטוי ושינויי epigenetic להתרחש באופן ספציפי רקמות, הוא חיוני, כדי להבדיל בין רקמות וסוגי תאים כדי להיות מסוגל לזהות שינויים בגנום וepigenome שעלול להוביל להתפתחות של מחלה. שיטה זו יכולה להיות מותאמת לכל סוג של תא בהווה דם טבורים בכל שלב של דיפרנציאציה. שיטה זו כוללת 4 שלבים עיקריים. ראשית, תאי mononuclear מופרדים על ידי צנטריפוגה צפיפות. שנית, תאי B מועשרים באמצעות נוגדנים מצומדות ביוטין שמכירים ולהסיר תאי B שאינם מתאי mononuclear. שלישית את B-תאים מסומנים fluorescently עם נוגדני חלבון בתא שטח ספציפיים לשלבים בודדיםהתפתחות תא B-. לבסוף, את התאים שכותרתו fluorescently מסודרים ואוכלוסיות בודדות הם התאוששו. התאים התאוששו הם בכמות ובאיכות מספקות כדי להיות מנוצלת במבחני חומצות גרעין במורד זרם.

בין מדגם וריאציה משחקת תפקיד בהצלחה של מיון התא (טבלה 1). את הדגימות עם שיעורי הצלחה טובים יש רמות נמוכות של פסולת מזהמת (איור 3 א) ואת הדגימות עם שיעורי הצלחת עניים יש רמות גבוהות של פסולת מזהמת (איור 3 ב &#39;). בין מדגם וריאציה ניתן לשלוט במידה מסוימת אם דגימת דם הטבורים שנאספה תוך 24 שעות ממשלוח (העדיפות הראשונה O / N). התאים הממוינים הזרימה מכל תת מבשר תא B הם כמות ובאיכות לביצוע בידודי חומצות גרעין מספיק. דנ&quot;א המבודד הוא באיכות גבוהה והוא יכול לשמש בניתוחים במורד זרם. אנחנו באופן שגרתי לנצל דנ&quot;א זה ב11 מירה להעשיר לDNA מפוגל (איור 4). <table border="1" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> נתוני מתקן דם טבורים </td><td> מיין עניים </td><td><strong&gt; מיין טוב </td></tr><tr><td> נפח עבודת דם עם נוגד קרישה (מ&quot;ל) </td><td> 110 </td><td> 104 </td></tr><tr><td> תאי דם לבנים [10 3 / μl] </td><td> 8.68 </td><td> 11.19 </td></tr><tr><td> הלימפוציטים [10 3 / μl] </td><td> 3.88 </td><td> 3.76 </td></tr><tr><td> הלימפוציטים (%) </td><td> 44.70 </td><td> 33.6 </td></tr><tr><td> תאי דם אדומים [10 6 / μl] </td><td> 3.65 </td><td> 3.05 </td></tr><tr><td colspan="3"> נתונים בתוך הבית </td></tr><tr><td> מספר סלולרי לאחר Ficoll-Paque </td><td> 206 M </td><td> 309 M </td></tr><tr><td> מספר סלולרי לאחר הפרדת MACS </td><td> ז 22 </td><td> 16.5 M </td></tr><tr><td> רוזן אירועים סה&quot;כ (MoFlo XDP) </td><td> 30.57 M </td><td> 19.97 M </td></tr><tr><td> כדאיות (%) </td><td> 98.00 </td><td> 98.00 </td></tr><tr><td> תאים בשער ימפוציט (%) </td&gt; <td> 17.00 </td><td> 50.00 </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 + </td></tr><tr><td> סה&quot;כ מספר סלולרי </td><td> 10959 </td><td> 48316 </td></tr><tr><td> % של סה&quot;כ אירועים </td><td> 0.04 </td><td> 0.24 </td></tr><tr><td> יעילות </td><td> 88% </td><td> 88% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 הנמוך </td></tr><tr><td> סה&quot;כ מספר סלולרי </td><td> 16619 </td><td> 26941 </td></tr><tr><td> % של סה&quot;כ אירועים </td><td> 0.05 </td><td> 0.13 </td></tr><tr><td> יעילות </td><td> 89% </td><td> 87% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 רפואה </td></tr><tr><td> סה&quot;כ מספר סלולרי </td><td> 469745 </td><td> 507540 </td></tr><tr><td> % של סה&quot;כ אירועים </td><td> 1.54 </td><td> 2.54 </td></tr><tr><td> יעילות </td><td> 89% </td><td> 89% </td></tr><tr><td colspan="3"> CD19 + / CD34 - / CD45 הגבוה </td></tr><tr><td> סה&quot;כ מספר סלולרי </td><td> 1896062 </td><td> 2047142 </td></tr><tr><td> % של סה&quot;כ אירועים </td><td> 6.2 </td><td> 10.25 </td></tr><tr><td> יעילות </td><td> 91% </td><td> 90% </td></tr></tbody></table> טבלת 1. סטטיסטיקת נציג תא מיון. 1-5 שורות הן ספירות הניתנות על ידי מתקן דם הטבורים. את השורות שנותרו הן נתונים שנאספו במעבדה שלנו. עלובים הכיל רמות גבוהות של פסולת ואחוז נמוך של תאי הלימפוציטים בשער. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig1.jpg" /> Figuמחדש 1. תרשים זרימה של הליך. דם טבורי מעובד ותאי mononuclear מבודדים באמצעות תוספת Ficoll-paque. צעד לשטוף נוסף כלול להסיר טסיות מזהמות. תאי B מבודדים מתאי mononuclear באמצעות ערכת MACS האנושית B-תא הבידוד (B-CLL). צעד זה נעשה שימוש בנוגדנים חד שבטי ביוטין-מצומדות (CD2, CD4, CD11b, CD36, Anti-IgE וCD235a) כדי להסיר את כל התאים שאינם B. את B-התאים התאוששו מסומנים עם CD19-APC, CD34-PE ונוגדני CD45-FITC לאחר מכן ממוינים באמצעות cytometer MoFlo XDP הזרימה להתאושש תת מבשר B-cell: CD19 + / CD34 +; CD19 + / CD34 - / CD45 נמוך ; CD19 + / CD34 - / CD45 מד; וCD19 + / CD34 - / CD45 גבוה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig2.jpg" /> איור 2. אסטרטגית gating לזיהוי ומיון פופulations. חיצים אדומים מציין את השער שחל על מגרש בהמשך. R4, R5, R6 וR7 שערים מצביעים אוכלוסיות ממוינות.) קדימה לעומת עלילת פיזור צד הצגת אוכלוסיית הלימפוציטים מועשרים. שער R1, הלימפוציטים. ב) גובה מול רוחב של עלילת פיזור קדימה לזיהוי תאים לעומת כפילויות בודדות. R2 שער, תא בודד. ג) תאים חיוביים CD19-APC לנפול לאוכלוסיות CD34-PE שליליות וחיוביות. R3, CD19 + / CD34 - שער; R4, CD19 + / CD34 + אוכלוסיית מין רצוי המציין שער ד) CD19 + / CD34 - תאים מתחלקים לשלוש אוכלוסיות שונות במקצת CD45-FITC.. R5 ו R6, CD19 + / CD34 - / CD45 נמוך וCD19 + / CD34 - / CD45 אוכלוסיות med, בהתאמה. R7, בגלל מספר תאים גבוה בCD19 + / CD34 - / CD45 אוכלוסייה גבוהה, שער מסוג זה מקיף רקחלק מהאוכלוסייה. כל התאים של אוכלוסייה זו לא צריכות להיות שנאספו עבור ניתוחים במורד זרם. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig3.jpg" /> איור 3.) רמות נמוכות של זיהום פסולת לאחר העשרת עמודה. R1, שער לימפוציטים. ב) רמות גבוהות של זיהום פסולת לאחר העשרת עמודה. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/50402/50402fig4.jpg" /> איור 4. העשרה של DNA המפוגל מתת קבוצות של מבשר תאי B. DNA) sonicated המבודד מתת מבשר B-cell היא באיכות גבוהה. לדנ&quot;א בניית הספרייה sonicated לממוצע של 200-600 נקודתי בסיס. 1 ליין: 100 סולם Promega נ&quot;ב (קטלוג # G2101); ליין 2: DNA סה&quot;כ מבודדים מCD19 + / CD34 + תאים; 3 ליין: DNA סה&quot;כ מבודדים מCD19 + </sעד&gt; / CD34 - / תאי CD45 נמוכים; ליין 4: 100 ng DNA המבודד מCD19 + / CD34 - / תאי CD45 מד; ליין 5: 100 ng DNA המבודד מCD19 + / CD34 - CD45 / תאים גבוהים. DNA היה sonicated באמצעות Bioruptor Diagenode על גבוה עבור סכום כולל של 9 דקות (30 שניות על; 30 השניות OFF). ה-DNA הייתה מטוהרת עמודה ומדמיינת על 1% agarose ג&#39;ל עם ג&#39;ל חומצות גרעין SYBR הכתם הירוק. ב) לאחר מירה באמצעות ActivMotif MethylCollector Ultra הערכה, PCR עם SLC25A37 (1-6) וAPC1 (7-12) מבוצע כדי לאשר העשרה של DNA המפוגל. 1 &amp; 7: DNA sonicated גנומית (לא מירה); 2 &amp; 8: מירה-CD19 + / CD34 + DNA; 3 &amp; 9: מירה-CD19 + / CD34 - / CD45-DNA הנמוך; 4 &amp; 10: מירה-CD19 + / CD34 - / CD45 התרופה ה-DNA; 5 &amp; 11: מירה -CD19 + / CD34 - / CD45-DNA גבוה; 6 &amp; 12: שליטת מים. הגברה גבוהה יותר של SLC25A37 מאשרת את ההעשרה של ה-DNA המפוגלבתת קבוצות של מבשר תאי B.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood at JoVE.com

Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

כאן אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תת קבוצות של מבשר B-תאים מדם הטבורי. כמות ואיכות מספקת של חומצות גרעין עשויה להיות מופקים מהתאים והשתמשו במבחנים הבאים ניצול DNA או RNA.

בידוד של קבוצות משנה מבשר B-cell מדם טבורים

Umbilical cord blood is highly enriched for hematopoietic progenitor cells at different lineage commitment stages. We have developed a protocol for ...

isolation-of-precursor-b-cell-subsets-from-umbilical-cord-blood

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

17.8K Views.  University of Missouri-Columbia. כאן אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תת קבוצות של מבשר B-תאים מדם הטבורי. כמות ואיכות מספקת של חומצות גרעין עשויה להיות מופקים מהתאים והשתמשו במבחנים הבאים ניצול DNA או RNA.

Video: Isolation of Precursor B-cell Subsets from Umbilical Cord Blood

Depletion of Specific Cell Populations by Complement Depletion

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions. In particular, molecular approaches such as real-time PCR and microarray analysis require the isolation of cell populations with high purity. Commonly used purification strategies include fluorescent activated cell sorting (FACS), magnetic bead separation and complement depletion. Of the three strategies, complement depletion offers the advantages of being fast, inexpensive, gentle on the cells and a high cell yield. The complement system is composed of a large number of plasma proteins that when activated initiate a proteolytic cascade culminating in the formation of a membrane-attack complex that forms a pore on a cell surface resulting in cell death1. The classical pathway is activated by IgM and IgG antibodies and was first described as a mechanism for killing bacteria. With the generation of monoclonal antibodies (mAb), the complement cascade can be used to lyse any cell population in an antigen-specific manner. Depletion of cells by the complement cascade is achieved by the addition of complement fixing antigen-specific antibodies and rabbit complement to the starting cell population. The cells are incubated for one hour at 37&deg;C and the lysed cells are subsequently removed by two rounds of washing. MAb with a high efficiency for complement fixation typically deplete 95-100% of the targeted cell population. Depending on the purification strategy for the targeted cell population, complement depletion can be used for cell purification or for the enrichment of cell populations that then can be further purified by a subsequent method.

To effectively study the function of immune cell populations their purification is often required. Complement depletion is a fast and inexpensive technique for the isolation of immune cell populations with high purity.

דלדול של אוכלוסיות תאים ספציפיים על ידי דלדול משלים

The purification of immune cell populations is often required in order to study their unique functions.  In particular, molecular approaches such as ...

Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal tract and other viscera. It harbors a number of immune cells including macrophages, B cells and T cells. The presence of a high number of na&iuml;ve macrophages in the peritoneal cavity makes it a preferred site for the collection of na&iuml;ve tissue resident macrophages (1). The peritoneal cavity is also important to the study of B cells because of the presence of a unique peritoneal cavity-resident B cell subset known as B1 cells in addition to conventional B2 cells. B1 cells are subdivided into B1a and B1b cells, which can be distinguished by the surface expression of CD11b and CD5. B1 cells are an important source of natural IgM providing early protection from a variety of pathogens (2-4). These cells are autoreactive in nature (5), but how they are controlled to prevent autoimmunity is still not understood completely. On the contrary, CD5+ B1a cells possess some regulatory properties by virtue of their IL-10 producing capacity (6). Therefore, peritoneal cavity B1 cells are an interesting cell population to study because of their diverse function and many unaddressed questions associated with their development and regulation. The isolation of peritoneal cavity resident immune cells is tricky because of the lack of a defined structure inside the peritoneal cavity. Our protocol will describe a procedure for obtaining viable immune cells from the peritoneal cavity of mice, which then can be used for phenotypic analysis by flow cytometry and for different biochemical and immunological assays.

The peritoneal cavity in mammals contains different immune cell populations crucial for innate immune responses. An efficient isolation method is required for biochemical and functional analyses of these cells. Here we provide a comprehensive method for the isolation of peritoneal cavity cells in the mouse.

בידוד של תאים עכבר פריטוניאלית חלל

The peritoneal cavity is a membrane-bound and fluid-filled abdominal cavity of mammals, which contains the liver, spleen, most of the gastro-intestinal ...

Isolation of Brain and Spinal Cord Mononuclear Cells Using Percoll Gradients

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required to define their phenotype and effector functions. Histochemical approaches are instrumental to determine the location of the infiltrating cells and to analyze the associated CNS pathology. However, in-situ histochemistry and immunofluorescent staining techniques are limited by the number of antibodies that can be used at a single time to characterize immune cell subtypes in a particular tissue. Therefore, histological approaches in conjunction with immune-phenotyping by flow cytometry are critical to fully characterize the composition of local CNS infiltration. This protocol is based on the separation of CNS cellular suspensions over discontinous percoll gradients. The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for identification of various immune cell populations in a single sample by flow cytometry.

The current article describes a rapid protocol to efficiently isolate mononuclear cells from brain and spinal cord tissues that can be effectively utilized for flow cytometric analyses.

בידוד של המוח ותאי חוט השדרה mononuclear שימוש Percoll Gradients

Isolation of immune cells that infiltrate the central nervous system (CNS) during infection, trauma, autoimmunity or neurodegeneration, is often required ...

Expanding Cytotoxic T Lymphocytes from Umbilical Cord Blood that Target Cytomegalovirus, Epstein-Barr Virus, and Adenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where the CB does not contain appreciable numbers of virus-experienced T cells which can protect the recipient from infection.1-4 We and others have shown that virus-specific CTL generated from seropositive donors and infused to the recipient are safe and protective.5-8 However, until recently, virus-specific T cells could not be generated from cord blood, likely due to the absence of virus-specific memory T cells. 
In an effort to better mimic the in vivo priming conditions of na&iuml;ve T cells, we established a method that used CB-derived dendritic cells (DC) transduced with an adenoviral vector (Ad5f35pp65) containing the immunodominant CMV antigen pp65, hence driving T cell specificity towards CMV and adenovirus.9 At initiation, we use these matured DCs as well as CB-derived T cells in the presence of the cytokines IL-7, IL-12, and IL-15.10 At the second stimulation we used EBV-transformed B cells, or EBV-LCL, which express both latent and lytic EBV antigens. Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL are used to stimulate the T cells in the presence of IL-15 at the second stimulation. Subsequent stimulations use Ad5f35pp65-transduced EBV-LCL and IL-2. 
From 50x106 CB mononuclear cells we are able to generate upwards of 150 x 106 virus-specific T cells that lyse antigen-pulsed targets and release cytokines in response to antigenic stimulation.11 These cells were manufactured in a GMP-compliant manner using only the 20% fraction of a fractionated cord blood unit and have been translated for clinical use.

Here we describe the first good manufacturing practice (GMP)-compliant method of producing virus-specific cytotoxic T lymphocytes (CTL) from umbilical cord blood, a source of predominantly na&#238;ve T cells.

הרחבת לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיים מדם טבורים שציטומגלווירוס יעד, וירוס אפשטיין באר, וadenovirus

Virus infections after stem cell transplantation are among the most common causes of death, especially after cord blood (CB) transplantation (CBT) where ...

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer a biologic product with the potential for superior (i) recognition of tumor-associated antigens (TAAs), (ii) persistence after infusion, (iii) potential for migration to tumor sites, and (iv) ability to recycle effector functions within the tumor microenvironment. Most approaches to genetic manipulation of T cells engineered for human application have used retrovirus and lentivirus for the stable expression of CAR1-3. This approach, although compliant with current good manufacturing practice (GMP), can be expensive as it relies on the manufacture and release of clinical-grade recombinant virus from a limited number of production facilities. The electro-transfer of nonviral plasmids is an appealing alternative to transduction since DNA species can be produced to clinical grade at approximately 1/10th the cost of recombinant GMP-grade virus. To improve the efficiency of integration we adapted Sleeping Beauty (SB) transposon and transposase for human application4-8. Our SB system uses two DNA plasmids that consist of a transposon coding for a gene of interest (e.g. 2nd generation CD19-specific CAR transgene, designated CD19RCD28) and a transposase (e.g. SB11) which inserts the transgene into TA dinucleotide repeats9-11. To generate clinically-sufficient numbers of genetically modified T cells we use K562-derived artificial antigen presenting cells (aAPC) (clone #4) modified to express a TAA (e.g. CD19) as well as the T cell costimulatory molecules CD86, CD137L, a membrane-bound version of interleukin (IL)-15 (peptide fused to modified IgG4 Fc region) and CD64 (Fc-&gamma; receptor 1) for the loading of monoclonal antibodies (mAb)12. In this report, we demonstrate the procedures that can be undertaken in compliance with cGMP to generate CD19-specific CAR+ T cells suitable for human application. This was achieved by the synchronous electro-transfer of two DNA plasmids, a SB transposon (CD19RCD28) and a SB transposase (SB11) followed by retrieval of stable integrants by the every-7-day additions (stimulation cycle) of &gamma;-irradiated aAPC (clone #4) in the presence of soluble recombinant human IL-2 and IL-2113. Typically 4 cycles (28 days of continuous culture) are undertaken to generate clinically-appealing numbers of T cells that stably express the CAR. This methodology to manufacturing clinical-grade CD19-specific T cells can be applied to T cells derived from peripheral blood (PB) or umbilical cord blood (UCB). Furthermore, this approach can be harnessed to generate T cells to diverse tumor types by pairing the specificity of the introduced CAR with expression of the TAA, recognized by the CAR, on the aAPC.

Clinical Application of Sleeping Beauty and Artificial Antigen Presenting Cells to Genetically Modify T Cells from Peripheral and Umbilical Cord Blood

T cells expressing a CD19-specific chimeric antigen receptor (CAR) are infused as investigational treatment of B-cell malignancies in our first-in-human gene therapy trials. We describe genetic modification of T cells using the Sleeping Beauty (SB) system to introduce CD19-specific CAR and selective propagation on designer CD19+ artificial antigen presenting cells.

יישום קליני של<em&gt; יפהפה נרדם</em&gt; ומלאכותי תאי מציגי אנטיגן גנטי לשינוי תאי T מדם טבורים היקפי וטבורים

The potency of clinical-grade T cells can be improved by combining gene therapy with immunotherapy to engineer  a biologic product with the potential for ...

Development of an IFN-&#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, antiherpetic prophylaxis is administrated systematically to pediatric UCBT recipients to prevent complications associated with VZV infection, but there is no strong, evidence based consensus that defines its optimal duration. Because T cell mediated immunity is responsible for the control of VZV infection, assessing the reconstitution of VZV specific T cell responses following UCBT could provide indications as to whether prophylaxis should be maintained or can be discontinued. To this end, a VZV specific gamma interferon (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay was developed to characterize IFN-&#947; production by T lymphocytes in response to in vitro stimulation with irradiated live attenuated VZV vaccine. This assay provides a rapid, reproducible and sensitive measurement of VZV specific cell mediated immunity suitable for monitoring the reconstitution of VZV specific immunity in a clinical setting and assessing immune responsiveness to VZV antigens. &#160;

Development of an IFN-&amp;#947; ELISpot Assay to Assess Varicella-Zoster Virus-specific Cell-mediated Immunity Following Umbilical Cord Blood Transplantation

Novel generations of functional assays such as gamma interferon (IFN-&#947;) ELISpot, which detect cytokine production at the single cell level and provide both quantitative and qualitative characterization of T cell responses can be used to assess cell-mediated immune responses directed against varicella zoster virus (VZV).

פיתוח של חסינות ELISPOT Assay להעריך γ-IFN אבעבועות רוח, זוסטר וירוס ספציפי לתא בתיווך לאחר השתלת דם טבורים

Varicella zoster virus (VZV) is a significant cause of morbidity and mortality following umbilical cord blood transplantation (UCBT). For this reason, ...

Mouse Na&#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition of cognate antigen presented on MHC class II. The cytokine signals present in the environment at the time of TCR activation are a major factor in determining the effector fate of a na&#239;ve CD4+ T cell. Although the cytokine environment during na&#239;ve T cell activation may be complex and involve both redundant and opposing signals in vivo, the addition of various cytokine combinations during naive CD4+ T cell activation in vitro can readily promote the establishment of effector T helper lineages with hallmark cytokine and transcription factor expression. Such differentiation experiments are commonly used as a first step for the evaluation of targets believed to promote or inhibit the development of certain CD4+ T helper subsets. The addition of mediators, such as signaling agonists, antagonists, or other cytokines, during the differentiation process can also be used to study the influence of a particular target on T cell differentiation. Here, we describe a basic protocol for the isolation of na&#239;ve T cells from mouse and the subsequent steps necessary for polarizing na&#239;ve cells to various T helper effector lineages in vitro.

Mouse Na&amp;#239;ve CD4+ T Cell Isolation and In vitro Differentiation into T Cell Subsets

Na&#239;ve CD4+ T cells polarize to various subsets depending on the environment at the time of activation. The differentiation of na&#239;ve CD4+ T cells to various effector subsets can be achieved in vitro through the addition of T cell receptor stimuli and specific cytokine signals.

העכבר נאיבי CD4<sup&gt; +</supו&gt; בידוד תא T<em&gt; במבחנה</em&gt; בידול לתוך תת תא T

Antigen inexperienced (na&#239;ve) CD4+ T cells undergo expansion and differentiation to effector subsets at the time of T cell receptor (TCR) recognition ...

An Efficient and High Yield Method for Isolation of Mouse Dendritic Cell Subsets

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen presenting molecules to initiate T-cell-mediated immunity. Dendritic cells can be separated into several phenotypically and functionally heterogeneous subsets. Three important subsets of splenic dendritic cells are plasmacytoid, CD8&#945;Pos and CD8&#945;Neg cells. The plasmacytoid DCs are natural producers of type I interferon and are important for anti-viral T cell immunity. The CD8&#945;Neg DC subset is specialized for MHC class II antigen presentation and is centrally involved in priming CD4 T cells. The CD8&#945;Pos DCs are primarily responsible for cross-presentation of exogenous antigens and CD8 T cell priming. The CD8&#945;Pos DCs have been demonstrated to be most efficient at the presentation of glycolipid antigens by CD1d molecules to a specialized T cell population known as invariant natural killer T (iNKT) cells. Administration of Flt-3 ligand increases the frequency of migration of dendritic cell progenitors from bone marrow, ultimately resulting in expansion of dendritic cells in peripheral lymphoid organs in murine models. We have adapted this model to purify large numbers of functional dendritic cells for use in cell transfer experiments to compare in vivo proficiency of different DC subsets.

Distinct dendritic cell subsets exist as rare populations in lymphoid organs, and therefore are challenging to isolate in sufficient numbers and purity for immunological experiments. Here we describe a high efficiency, high yield method for isolation of all of the currently known major subsets of mouse splenic dendritic cells.

שיטת תשואה יעילה גבוהה עבור בידוד של תת תא העכבר דנדריטים

Dendritic cells (DCs) are professional antigen-presenting cells primarily responsible for acquiring, processing and presenting antigens on antigen ...

Dextran Enhances the Lentiviral Transduction Efficiency of Murine and Human Primary NK Cells

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining the role of the gene of interest in the development, differentiation, and function of NK cells. Recent advances related to chimeric antigen receptors (CARs) in cancer immunotherapy accentuate the need for an efficient method to deliver exogenous genes to effector lymphocytes. The efficiencies of lentiviral-mediated gene transductions into primary human or mouse NK cells remain significantly low, which is a major limiting factor. Recent advances using cationic polymers, such as polybrene, show an improved gene transduction efficiency in T cells. However, these products failed to improve the transduction efficiencies of NK cells. This work shows that dextran, a branched glucan polysaccharide, significantly improves the transduction efficiency of human and mouse primary NK cells. This highly reproducible transduction methodology provides a competent tool for transducing human primary NK cells, which can vastly improve clinical gene delivery applications and thus NK cell-based cancer immunotherapy.

The goal of this study was to formulate technologies that allow for successful gene transduction in primary natural killer (NK) cells. The dextran-mediated lentiviral transduction of human or mouse primary NK cells results in higher gene expression efficiencies. This method of gene transduction will vastly improve NK cell genetic manipulation.

לתוספי משפר את היעילות התמרה חושית Lentiviral של תאי NK העיקרי מאתר ואנושי

The efficient transduction of specific genes into natural killer (NK) cells has been a major challenge. Successful transductions are critical to defining ...

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells differentiate to form platelet precursors called megakaryocytes, which terminally differentiate to release platelets from long cytoplasmic processes termed proplatelets. Megakaryocytes are rare cells confined to the bone marrow and are therefore difficult to harvest in sufficient numbers for laboratory use. Efficient production of human megakaryocytes can be achieved in vitro by culturing CD34+ cells under suitable conditions. The protocol detailed here describes isolation of CD34+ cells by magnetic cell sorting from umbilical cord blood samples. The necessary steps to produce highly pure, mature megakaryocytes under serum-free conditions are described. Details of phenotypic analysis of megakaryocyte differentiation and determination of proplatelet formation and platelet production are also provided. Effectors that influence megakaryocyte differentiation and/or proplatelet formation, such as anti-platelet antibodies or thrombopoietin mimetics, can be added to cultured cells to examine biological function.

Megakaryocyte Differentiation and Platelet Formation from Human Cord Blood-derived CD34+ Cells

A highly pure population of megakaryocytes can be obtained from cord blood-derived CD34+ cells. A method for CD34+ cell isolation and megakaryocyte differentiation is described here.

מגקריוציט בידול ויצירת טסית דם מן האדם כבל CD34 נגזר דם תאים+

Platelet production occurs principally in the bone marrow in a process known as thrombopoiesis. During thrombopoiesis, hematopoietic progenitor cells ...