בסרטון זה, אנו מתארים מחקר מודל למנגנון של רעילות עמילואיד ברמת הממברנה באמצעות מיטוכונדריה במוח עכברוש כמודל ביולוגי במבחנה. למרות דו"ח מצטבר המתאר מנגנון של הפרעות קרום על ידי צבירה עמילואיד במערכות מודל פוספוליפיד למד ישירות מיקוד האירועים החל בפיתוח קרום ביולוגי. בסרטון הנוכחי, אנו מתארים fibrils עמילואיד של אלפא-סינוקלין ניתוח קרום המיטוכונדריה במוח החולדה כמודל ביולוגי במבחנה.
אנו מאמינים כי המיטוכונדריה כאברון עם קרום מאופיין היטב עשוי לספק מערכת מודל ביולוגי שימושי מאוד עבור מחקרים מולקולריים הקשורים למנגנון של ציטוקסיות עמילואיד ברמת הממברנה הקשורים למחלות ניווניות. ערפו את ראשו של החולדה בגיליוטינה של בעלי חיים קטנים והוציאו את המוח מהסולם תוך דקה אחת מעורף החולדה כדי להגביל הידרדרות אפשרית של תכונות המיטוכונדריות. חשוב לעבוד במהירות ולשמור הכל על הקרח לאורך כל ההליך.
לשטוף את הרקמה פעמיים עם 30 מיליליטר של חיץ בידוד. מעבירים למקורה המכילה חיץ בידוד קר וטחון דק את המוח במספריים. העבר את ההשעיה רקמה כדי homogenizer 20 מיליליטר קר dounce.
הומוגניזציה של חתיכות הרקמה באמצעות תשע משיכות למעלה ולמטה עם עלה ממונע. השאירו את התערובת על הקרח למשך כ-30 שניות לאחר כל קבוצה של שלוש משיכות הומוגניזציה כדי להבטיח שההומוגניאט יישאר קר. מעבירים את ההומוגנטי לצינור צנטריפוגה מקורר מראש וצנטריפוגה ב 1, 300 G בארבעה Centigrade במשך שלוש דקות.
בזהירות decant את supernatant ולהעביר אותו צינור צנטריפוגה מקורר מראש. צנטריפוגה ב 21, 000 G בארבעה סנטיגרד במשך 10 דקות. השליכו את העל-טבעי והתינו מחדש את גלולת הכדור במדיום שיפוע צפיפות על ידי ערבוב עדין של התערובת עם הפיפט.
צנטריפוגה ברוטור זווית קבועה ב 30, 700 G בארבעה סנטיגרד במשך חמש דקות. באמצעות פיפטה פסטר, להסיר את הקצה החד של חומר שנצבר בחלק העליון, אשר מכילים בעיקר מילין. מוסיפים חיץ בידוד של שמונה מיליליטר לשבר המיטוכונדריאלי תוך ערבוב עדין של התערובת עם הפיפסה.
צנטריפוגה ב 16, 700 G בארבעה סנטיגרד במשך 10 דקות. בזהירות להסיר את supernatant, משאיר את גלולה רופפת התחתונה באין מפריע. הוסיפו מיליליטר אחד של 10 מיליגרם ל-BSA נטול חומצות שומן מיליליטר לצינור צנטריפוגה תוך ערבוב עדין של התערובת עם קצה הפיפט.
הפוך את עוצמת הקול לחמישה מיליליטר על-ידי הוספת מאגר בידוד. צנטריפוגה ב 6, 900 G בארבעה סנטיגרד במשך 10 דקות. זה אמור לייצר גלולה מוצקה.
תפענחו את העל-טבעי ותתנו מחדש בעדינות את גלולת המיטוכונדריה במאגר הבידוד. לדלל הומוגנית מיטוכונדריאלית למיליגרם אחד למיליליטר עם חיץ בידוד קר ולמקום בשני צינורות 1.5 מיליליטר, בדרך כלל 195 microliter של מיטוכונדריה לכל צינור. הוסף חמישה מיקרוליטר 20% נפח לכל נפח טריטון X-100 לצינור אחד כבקרה חיובית עבור פעילות אנזים מקסימלית וחמישה מים deionized microliter לצינור אחר לשליטה, ואחריו ערבוב עם stirrer.
הדגירה את הצינורות במשך 10 דקות באמבט מים חמים להגדיר 30 Centigrade. גלולה מיטוכונדריה על ידי צנטריפוגה של צינורות רוטור זווית קבועה ב 16, 000 G ארבעה Centigrade במשך 15 דקות. בזהירות לאסוף supernatants וכתוצאה מכך להערכת הפעילות של מיטוכונדריאלי מלאט דהידרוגנאז באמצעות הערכה ספקטרופוטומטרית סטנדרטית המתוארת על החלק הבא.
חשב את שלמות הממברנה המיטוכונדרית כדלקמן. עבור קביעת פעילות malate dehydrogenase, פיפטה 890 ו 880 microliter 50 מילימולאר טריס-HCL חיץ כדי cuvettes בדיקה ריק מדגם בהתאמה ואחריו 100 microliter 50 oxaloacetate מילימולארי ו 10 microliter של 10 מילימולאר בטא-NADH. שים את cuvettes בספקטרופוטומטר והתייחסות נגד ריק.
הוסף 10 מיקרוליטר הומוגניאט מיטוכונדריאלי מיליגרם אחד למיליליטר כדי לדגום cuvette. מיד מערבבים על ידי היפוך. שיא ירידה בספיגה עקב חמצון NADH ב 340 ננומטר לדקה אחת.
עבור פרפור עמילואיד אלפא-סינוקליין, להוסיף 294 microliter של פתרון חלבון, 200 micromolar לכל צינור 1.5 מיליליטר. לאחר מכן להוסיף שישה מיקרוליטר פתרון ThT מילימולר אחד. מערבבים את הפתרונות ודחוסים את הצינורות בתרמומיקסר ב 37 Centigrade תחת ערבוב מתמיד ב 800 סל"ד.
עבור fibrillation עמילואיד אינסולין, להוסיף 637 microliter של פתרון חלבון, 250 micromolar כדי 1.5 צינור מיליליטר. לאחר מכן להוסיף 13 פתרון ThT microliter אחד מילימולר ואחריו ערבוב. הוסיפו 200 מיקרוליטר של פתרונות חלבון לכל באר של צלחת ברורה של 96 בארות.
לאטום את הצלחת עם סרט איטום ברור כשמש. טען את הצלחת לתוך ציטציה 5 קורא לוחיות פלואורסצנטיות. למדוד פלואורסצנטיות ThT במרווחים של 30 דקות במשך 12 שעות.
השתמש בגירוש ב 440 ננומטר ו פליטה ב 485 ננומטר. בחר את בארות. לנער את הצלחת במשך חמש שניות לפני כל מדידה.
הגדר את הטמפרטורה ב 57 סנטיגרד ללא תסיסה. הכינו שתי סדרות של צינורות 1.5 מיליליטר המכילים הומוגנטים מיטוכונדריאליים, סדרה אחת להסטת שחרור MDH וסדרה אחרת למדידת ROS מיטוכונדריאלי. הוסף aliquots של fibrils טריים או עמילואיד של אלפא-סינוקליין, אינסולין חזיר או ליזוזה לבן ביצה תרנגולת הומוגנית מיטוכונדריאלי ואחריו צינורות בעדינות.
צינורות דגירה המכילים מתלים מיטוכונדריאליים במשך 30 דקות באמבט מים חמים להגדיר 30 Centigrade. עבור מלט דהידרוגנאז לשחרר assay, צנטריפוגה דגירה הומוגניים מיטוכונדריאלי ב 16, 000 G במשך 15 דקות. בזהירות לאסוף supernatants וכתוצאה מכך להתוות את הפעילות של MDH המיטוכונדריאלי כמתואר בסעיף פרוטוקול חלק ארבע.
חשב את שחרורו של MDH באופן הבא. למדידת ROS מיטוכונדריאלי, פיפטה 191 מיקרוליטר של הומוגנית מיטוכונדריאלית מודגרת לכל באר של צלחת 96 באר. הוסף ארבעה מיקרוליטר של 50 DCFDA מיקרומולרית.
לאחר מכן להוסיף חמישה microliter של 200 מילימולרים succinate. הדגירה את הצלחת במשך 30 דקות באמבט מים חמים להגדיר 30 Centigrade תוך ערבוב עדין. לטעון את הצלחת לתוך ציטציה 5 קורא לוחיות פלואורסצנטיות ולמדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות על פי סעיף הפרוטוקול.
שלמות הממברנה המיטוכונדריאלית הוערכה על ידי מדידת פעילות MDH במיטוכונדריה המבודדת לפני ואחרי שיבוש קרום ושחרור אנזימים על ידי טריטון X-100. כפי שאתם רואים, מצאנו בדרך כלל כי ההכנות המיטוכונדריות הן כ 93% שלם. ThT פלואורסצנטיות הראיה בוצעה כדי לפקח על הצמיחה של שרירנים עמילואיד.
העקומה של פרפור עמילואיד של שלושה חלבונים הראתה דפוס סיגמואידלי טיפוסי, שהגיע לרמה בסביבות 96, 12 ו -96 שעות עבור אלפא-סינוקליין, אינסולין חזיר, lysozyme לבן ביצה תרנגולת בהתאמה, מה שמרמז על היווצרות של fibrils עמילואיד שאושרה יותר על ידי מדידת AFM. חלחלה אפשרית ונזק של קרום מיטוכונדריאלי על ידי fibrils עמילואיד נחקר על ידי שחרורו של MDH המיטוכונדריאלי ומדידת ROS המיטוכונדריאלי. כפי שאתה רואה בגרף השמאלי, שחרור משמעותי של MDH נצפתה על תוספת של fibrils עמילואיד אלפא-סינוקליין המיטוכונדריה.
בעוד שחרור קל זוהה על ידי אינסולין fibrils, תרנגולת ביצה לבן lysozyme fibrils נמצאו להיות יעיל. גרף ימני מראה את ההשפעה של fibrils עמילואיד על תוכן ROS המיטוכונדריאלי. אמנם אין שיפור משמעותי ROS המיטוכונדריאלי נצפתה על תוספת של lysozyme לבן ביצה תרנגולת או אינסולין עמילואיד fibrils, טיפול עם fibrils אלפא-סינוקליין הוביל לעלייה ניכרת בתתוכן ROS של המיטוכונדריה במוח.
הסרטון הנוכחי מתאר מחקר מודל למנגנון של ציטוקסיות ציטוקסיות מצרפית שוקית ברמת הממברנה, המדגים כיצד פירורי עמילואיד הנובעים מחלבונים שונים עלולים לגרום לדרגות שונות של נזק לממברנה וחדירה. בעוד כמה נושאים של fibrils עמילואיד ואת קרום מחייב ספציפי שלהם נראה לספק את היכולת לקיים אינטראקציה עם ולגרום חוסר יציבות וההטרדה הבאים של ממברנות. לאחר וידאו זה, תוכל לחקור את האינטראקציה של צורה מקומית, פרפור מראש, fibrils עמילואיד בוגרת של פפטידים שונים עם המיטוכונדריה מבודד מרקמות שונות או אזורים שונים של המוח.
