Name: in vitro assays to assess blood-brain barrier mesh-like vessel formation and disruption
Uploaded: 2017-06-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption at JoVE.com

ליאון טאי ממומן על ידי אוניברסיטת אילינוי שיקגו start-up קרנות.

כל הניסויים בצע את אוניברסיטת אילינוי, שיקגו מוסדיים טיפול בבעלי חיים ושימוש ועדת פרוטוקולים. 1. הכנה כללית הערה: המוח בתאי המוח האנדותל המוחית (hCMEC / D3) הוא קו BEC 14 , 15 , 16 , 18 , 19 . תרבות hCMEC / D3 תאים על צלוחיות רקמה תרבות מצופה קולגן סוג אני (עגל העור, 1:20 דילול של פתרון 0.1% ב Hank של תמיסת מלח מאוזן (HBSS) המכיל Ca 2 + ו Mg 2 + ) ב Basal צמיחה האנדותל הבסיס (EBM-2) המכיל 2-5% סרום שור העובר (FBS), חומצה אסקורבית 10%, 10% גנטמיצין גנטמיצין, 25% hydrocortisone ו 1/4 מהנפח הכולל של גורם הגדילה גדל גורם לכל 500 מ&quot;ל של התקשורת [ אנדותל כלי הדם(EGF), גורם גדילה דמוי-אינסולין (EGF), גורם גדילה דמוי אינסולין 1 (IGF-1) ופקטור הגידול הפיברובלסטי הבסיסי האנושי (bFGF), ראה טבלה של חומרים ]. הערה: מדיום EBM-2 עם FBS וגורמי גדילה נקראים &quot;EBM-2 Complete&quot;. EBM-2 ללא FBS ותוספות מכונה &quot;EBM-2 הבסיס&quot;. במפגש מלא, תאים hCMEC / D3 הם ~ 1 x 10 5 תאים / ס&quot;מ 2 . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבר תאים HCMEC / D3 ביחס של 1: 5 על ידי הדגירה הראשונה עם HBSS במשך 3 דקות ללא Ca 2 + ו Mg 2 + ואחריו ניתוק עם 5 מ&quot;ל טריפסין / EDTA (0.25%) במשך 5 דקות. לנטרל את טריפסין באמצעות EBM-2 מלאה (ניטרול 1: 1), ו צנטריפוגה ב x0 290 במשך 5 דקות ב 4 ° C; להשליך את supernatant. Resuspend גלולה ב EBM-2 להשלים מחדש צלחת ביחס 1: 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות האדם העיקרי pericytes ו astrocytes על פי פרוטוקול הספק [ טבלה של חומרים ]. תרבותיE pericytes במדיום הבסיסי pericyte עם FBS ותוספת גידול pericyte. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות האסטרוציטים האנושיים במדיום האסטרוציטים המכילים גורמי גדילת האסטרוציטים. התרבות הן pericytes ו astrocytes ב צלוחיות רקמה תרבות מצופה 3 מ&quot;ל של פולי- L- ליזין (PLL) עבור התא דבקות לנצל את התאים בין מעברים 2 ו - 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים 7 עכברים ולהסיר את הגבעולים במוח cerebella עם מלקחיים; לנתק את הקרום על ידי גלגול בזהירות את המוח על גזה. לשרוף את רקמת המוח הנותרת בצלחת פטרי במינימלי Essential בינוני (MEM) עם HEPES (5 מ&quot;ל לכל מוח) עם להב גילוח סטרילי. לבודד את BECs העכבר העיקרי של 2 חודשים בן C57BL / 6J עכברים על פי פרוטוקול הפניה 20 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הרקמה המוח טחנת צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. צנטריפוגה ב x0 290 במשך 5 דקות ב 4 ° C. הסר את supernatant ו דגירה הרקמה ב papain (833.33 μL לכל מוח) ו DNase (41.7 μL לכל מוח)פתרון, ב 37 מעלות צלזיוס אמבטיה במשך שעה 1, לעכל את הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Triturate homogenate ברצף באמצעות מחטים 19 ו 21 מד, לערבב ביחס 1: 1 עם פתרון Bowine בסרום 22 אלבומין (BSA), ו צנטריפוגות ב XG 1360 במשך 10 דקות ב 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה שהתקבל ב 1 מ&quot;ל EBM-2 מלאה צנטריפוגה ב x0 290 במשך 5 דקות ב 4 ° C. Resuspend שוב 1 מ&quot;ל EBM-2 מלא צלחת התאים (1 מ&quot;ל / טוב) על 6 צלחות היטב מצופה קולגן (~ 1 המוח לכל טוב). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את התקשורת 24 שעות מאוחר יותר עם EBM-2 להשלים המכיל 4 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​puromycin hydrochloride; להחליף עם EBM-2 להשלים לאחר 2 ימים. BECs העיקרי מתורבת כמו לתאי hCMEC / D3 והם במפגש מלא ב 1 x 10 5 תאים / ס&quot;מ 2 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מיקרומטר 100 של oAβ, 24 שעות לפני assay. הערה: oAβ נחשב בצורת המחלה הרלוונטית של A. עבור oAβ, השתמש היטב מאופיין ההכנות שתוארו על ידי DahlgreN et al. 21 . </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפשיר את הפתרון בממברנה במרתף המניה לילה ב 4 ° C ו aliquot לתוך סטרילי סטרילי PCR רצועות (8 צינורות) ב 140 קרום המרתף μL לכל צינור. Refreeze כל רצועה ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס. להפשיר רצועה אחת לכל 96 - גם צלחת על 4 מעלות צלזיוס, 24 שעות לפני assay. טרום מגניב טיפים פיפטה כדי למנוע התמצקות. הערה: כל הטיפול במטריצת הממברנה במרתף חייב להתבצע על הקרח כדי למנוע הידוק מהיר. כמו 10 μL לכל טוב של קרום במרתף משמש ביום assay, כל רצועה מספיקה עבור צלחת 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה BECs ומחוברות במלואה בבסיס EBM-2, 24 שעות לפני assay. הערה: הרציונל הוא: EBM-2 להשלים מכיל גורמים נוספו FBS במטרה לקדם את הצמיחה התא אופטימלית; אולם, אותם מסלולים מולקולריים המקדמים את צמיחת התאים חשובים גם לכיסוי תאי האנדותל של המוח ולדינמיקה, הן בנוכחות והן בשכיחותלא של לחץ. לכן, אנו מוסיפים את הרעל והורדים את BEC על מנת להפחית את האפקט המבלבל של הפעלה שיורית של מסלולי איתות סלולריים. שים לב, התאים הם בקצרה (5 דקות) חשופים FBS במהלך ניטרול של תאים trypsinized לפני assay. בניגוד BECs, pericytes ו astrocytes אינם מורעבים בסרום, בשל הדרישה של גורמים שונים לצמיחה וחוסר היציבות היחסית של סוגי תאים אלה בתגובה רעב בסרום (מעבדה טאי, תצפיות שלא פורסמו). הערה: הבסיס EBM-2 מנוצלת במהלך assay עבור יחיד ושלוש תרבות meshwork ו מבחני הפרעה. זה קריטי כדי למנוע בלבול confounding או טיפול תלוי איתות. </li></ol> 2. Meshwork- כמו גיבוש ו הפרעה Assays <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד BEC תרבות מבחני: הערה: שלוש פרדיגמות שונות עבור תרבויות יחיד של BECs מוצגים בתרשים 1A </חזקה&gt;. כל פרדיגמה נועדה להעריך את התגובה של BECs במודלים שונים של כיסוי כלי שיט. פרדיגמה 1 הוא מבנה רשת. פרדיגמה זו נועדה לבחון את ההשפעות של לחצים ו / או טיפולים על אנגיוגנזה ויצירת רשת. BECs, oAβ, וטיפולים מתווספים כולם לצלחת בנקודת הזמן 0 h. פרדיגמה 2 היא מניעת שיבושים ברשת. תאים מצופים בנוכחות גורם גדילה או סמים מודגרת במשך 4 שעות כדי ליצור מבנים דמויי רשת. לחץ, oAβ במקרה זה, נוסף לאחר 4 שעות. פרדיגמה זו מעריכה את היכולת של טיפול כדי למנוע נזק הנגרם על ידי לחץ, למבנים דמויי רשת. פרדיגמה 3 הוא טיפול בו-זמני של הפרעה ברשת. תאים מצופים מותר ליצור מבנים דמויי רשת כמו 4 שעות. טיפולים ו oAβ לאחר מכן הוסיף בו זמנית בנקודת זמן 4 שעות, להעריך את היכולת של רשת התא preformed להגיב טיפולים שונים. כל הפרדיגמותLlow צעדים נפוצים דומים, למעט עם ההבדלים בעיתוי של תוספת הטיפול. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום assay, פיפטה המטריצה ​​במרתף במרתף 10 μL / גם לתוך החלק התחתון של צלחות 96-היטב ולאפשר להגדיר עבור 1 שעה ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשעות את lyophilized תא ירוק מעקב צבע (ראה טבלה של חומרים ) ב 10 DMSO μL כדי ליצור פתרון מלאי 10 מ&quot;מ, ו לדלל ל 10 מיקרומטר (1: 1000) בבסיס EBM-2. הסר את התקשורת מן הבקבוק ומחוברות לחלוטין ולהחליף EBM-2 הבסיס המכיל את התא ירוק צבע מעקב (5 מ&quot;ל על בקבוק 75 ס&quot;מ 2 ). Preload BECs עם צבע ירוק מעקב התא, 20 דקות לפני תחילת assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים 20-30 דקות על 37 מעלות צלזיוס, להסיר את המדיום עם צבע התא מעקב, לנתק את התאים כמתואר בשלב 1.1. לנטרל את התקשורת עם EBM-2 המכיל 10% FBS ו צנטריפוגה ב XG 240 במשך 5 דקות ב 4 ° C. Resuspend גלולה ב 1 מ&quot;ל של EBM-2 הבסיס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחת BECs בצלחת 96-היטב ב 10,000 תאים / גם EBM-2 הבסיס (0 שעות נקודת הזמן בכל הפרדיגמות). הערה: בהתאם לפרדיגמה בשימוש, טיפולים, לחצים, או פקדי הרכב מתווספים בנקודות הזמן שצוין. בכל הפרדיגמות, המדיום נקצר לניתוח שלאחר מכן ( למשל ניתוח ELISA) ותאים קבועים ב 24 שעות עם paraformaldehyde 4% מוכן טרי ב פוספט שנאגרו בסרום (PBS). כגישה חלופית כדי לקבוע את ההשפעות טווח של oAβ על היווצרות רשת, הפרוטוקול יכול להיות שונה כדי מראש דגירה צלוחיות תרבות תאים confluent עם oAβ, ולאחר מכן לבצע את פרדיגמות היווצרות meshwork (+/- oAβ). הערה: נפח הסופי בכל טוב עבור כל הפרדיגמות הוא 70 μL. כל הטיפולים (oAβ, EGF, וכו &#39; ) מתווספים בארות בהתאמה שלהם בדילול 1:20 כלומר 3.5 μL לכל טיפול. עבור פרדיגמה 1, התאים מתווספים פתרון ההשעיה התא ב 63 μL / wEll. OAβ מיד, טיפולים הרצוי, ובקרות מתווספים 3.5 μL / טוב כל אחד, נותן סך של 70 μL. עבור פרדיגמה 2, 63 μL ההשעיה התא 3.5 μL של הטיפול ( למשל 100 ng / מ&quot;ל ​​EGF) מתווספים בנקודת זמן 0 h. לאחר הדגירה 4 שעות, 3.5 μL של מלאי oAβ נוסף ( למשל עבור 100 nM ריכוז oAβ הסופי, 3.5 μL של 2 מיקרומטר oAβ המניות). עבור פרדיגמה 3, 63 μL ההשעיה התא מתווסף בנקודת זמן 0 שעה ב 4 שעות, oAβ וטיפולים הרצוי מתווספים 3.5 μL / טוב כל אחד, נותן סך של 70 μL. כרכים אלה יכולים להיות מותאמים בהתאם לטיפולים. לדוגמה, אם רק טיפול אחד נדרש, נפח ההשעיה התא יכול להיות מותאם 66.5 μL (שמירה על 10,000 תאים / טוב) ואת נפח הטיפול יכול להישאר 3.5 μL. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אסאי תרבות משולשת: הערה: בנוסף מבחני תרבות אחת של BECs, יש לנו לפתחאד פרדיגמה assay תרבות משולשת ( איור 1 ב ) כדי לקבוע את התגובה של BECs, pericytes, ו astrocytes בתוך רשתות preformed כדי רלוונטיים stressors ( למשל oAβ). BECs מצופה בנוכחות טיפולים הרצוי ב 0 h. ב 4 שעות, pericytes מתווספים בעדינות לצלחת. בשעה 7 שעות, אסטרוציטים מתווספים לצלחת, ואחריו תוספת של מתח ב 11 שעות. תאים מודגרת אז עד נקודת זמן 24 שעות. הערה: עבור מבחני תרבות משולשת, חשוב לשקול עיתוי כדי להבטיח שכל התאים מחוברים בו זמנית. אסטרוציטים אנושיים pericytes צריך להיות מתורבת 1 שבוע לפני assay, ואילו hCMEC / D3 תאים צריך להיות מצופה או passaged 4-5 ימים לפני תאריך assay. יתר על כן, חשוב להשתמש במעבר נמוך (2-5) תאים ראשוניים, כדי למנוע סחיפה פנוטיפי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את התא הירוק מעקב צבע עובד פתרון לתאי hCMEC / D3 20 דקות לפני תחילת assay. פלייט את hCMEC / D3 תאים בשעה 10, 000 תאים / גם EBM-2 הבסיס (0 שעות נקודת זמן). הכרכים המשמשים 45 μL ההשעיה התא 3.5 μL של טיפול ( כלומר ריכוז EGF הסופי של 50 ng / mL, 100 ng / mL, או 1000 ng / mL ממניות כי הם 20 פעמים מרוכז יותר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה 3.5 שעות על 37 מעלות צלזיוס, מוסיפים את התא הכחול מעקב צבע עובד פתרון (10 מיקרומטר תא גשש כחול EBM-2 הבסיס) כדי pericytes העיקרי האדם. בנקודת זמן 4 שעות (~ 30 דקות הדגירה עם צבע מעקב התא), בעדינות להוסיף 2000 pericytes / גם על הצלחת המכילה את hCMEC / D3 בנפח של 6 μL / טוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה 2.5 שעות נוספות (סה&quot;כ 6.5 שעות מ 0 נקודת זמן שעה), להוסיף את התא כתום מעקב צבע פתרון עובד (10 מיקרומטר תא גשש כתום EBM-2 הבסיס) כדי האסטרוציטים העיקרי האדם. בנקודת זמן 7 שעות, בעדינות להוסיף 10,000 astrocytes / גם את הצלחת נפח 12 μL. לכן, היחס הסלולרי הכולל לתאי האנדותל: pericytes: astrocytes iS 5: 1: 5. יתר על כן, נפח שהושג לנקודה זו הוא 66.5 μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף oAβ (3.5 μL של 100 מיקרומטר המניה) 4 שעות מאוחר יותר (סה&quot;כ 11 שעות מ 0 נקודת זמן שעה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את התאים 13 שעות מאוחר יותר paraformaldehyde 4% מוכן טרי PBS. זהירות: ללבוש ביגוד מגן, כפפות, משקפיים תוך טיפול paraformaldehyde. </li></ol></li></ol> 3. כימות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללכוד תמונות הקרינה של כל טוב של צלחת 96-היטב בהגדלה 1.6X עם זמן חשיפה של 2 ב 50% כוח מקסימלי באמצעות מיקרוסקופ לנתח. הערה: מיקרוסקופים שווה יכול להיות מנוצל; עם זאת, זה קריטי כדי ללכוד את הבאר כולו לניתוח מקיף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשם ניתוח כמותי, לעבד את התמונות באמצעות ImageJ angiogenesis תוסף plugin 22 לכמת את מספר הענפים, מספר meshes, ואת אורך התא הכולל (אלה readouts הם tabulated באופן אוטומטי על ידי softwaRe) כמתואר להלן. פרוטוקול חזותי מפורט של שלב זה מסופק באיור 2 . <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את fiji ImageJ על-ידי לחיצה על סמל התוכנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על חצים קדימה אדום אדום הממוקם בסוף סרגל הכלים, ולאחר מכן לחץ על &quot;אנגיוגנזה Analyzer&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את התיקיה עם קבצי תמונה, לחץ על &quot;פתח&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מופיעה תיבת &quot;הגדרות לניתוח&quot;, לחץ על &quot;אישור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מופיעה תיבת &quot;עיבוד תמונות&quot;, המציינת את מספר התמונות שיש לעבד, לחץ על &quot;אישור&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מופיעה תיבת &quot;חלון התקדמות אצווה&quot;, המציינת את זמן העיבוד המשוער. במהלך תקופה זו התוכנית לכמת את התפוקות, כולל מספר סניפים, מספר meshes, ואת אורך התא הכולל. הערה: לאחר הכנת כל התמונות, קובץ התוצאות יופיע בתיקיית התמונה המקורית כמסמך גיליון אלקטרוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחרקובץ הגיליון המכיל תוצאות ולהשוות את מספר הענפים, הרשתות ואורך התא הכולל בין הקבוצות. הערה: בתרשים assay תרבות משולש ImageJ מנוצל עוד יותר כדי לנתח כיסוי pericyte / astrocyte ומספר. תמונות הם thresholded על ידי נסיין עיוור ואת &quot;לנתח חלקיקים&quot; פונקציה מנוצל כדי ליצור readouts. תאים קבועים כמו מבנים דמויי צינור יכול גם להיות immunostained עבור Aβ 17 או סמנים אחרים. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Abbott, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+structure+and+function+and+the+challenges+for+CNS+drug+delivery.">Blood-brain barrier structure and function and the challenges for CNS drug delivery.</a> J Inherit Metab Dis. 36 (3), 437-449 (2013).</li><li>Engelhardt, B., Liebner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+into+the+development+and+maintenance+of+the+blood-brain+barrier.">Novel insights into the development and maintenance of the blood-brain barrier.</a> Cell Tissue Res. 355 (3), 687-699 (2014).</li><li>Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+the+blood-brain+barrier.">Structure and function of the blood-brain barrier.</a> Neurobiol Dis. 37 (1), 13-25 (2010).</li><li>Zlokovic, B. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurovascular+pathways+to+neurodegeneration+in+Alzheimer's+disease+and+other+disorders.">Neurovascular pathways to neurodegeneration in Alzheimer's disease and other disorders.</a> Nat Rev Neurosci. 12 (12), 723-738 (2011).</li><li>Pardridge, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+delivery+of+protein+and+gene+medicines+through+the+blood-brain+barrier.">Targeted delivery of protein and gene medicines through the blood-brain barrier.</a> Clin Pharmacol Ther. 97 (4), 347-361 (2014).</li><li>Tai, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+APOE+in+cerebrovascular+dysfunction.">The role of APOE in cerebrovascular dysfunction.</a> Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).</li><li>Biron, K. E., Dickstein, D. L., Gopaul, R., Jefferies, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+triggers+extensive+cerebral+angiogenesis+causing+blood+brain+barrier+permeability+and+hypervascularity+in+Alzheimer's+disease.">Amyloid triggers extensive cerebral angiogenesis causing blood brain barrier permeability and hypervascularity in Alzheimer's disease.</a> PLoS One. 6 (8), e23789 (2011).</li><li>Cameron, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alzheimer's-related+peptide+amyloid-beta+plays+a+conserved+role+in+angiogenesis.">Alzheimer's-related peptide amyloid-beta plays a conserved role in angiogenesis.</a> PLoS One. 7 (7), e39598 (2012).</li><li>Boscolo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta+amyloid+angiogenic+activity+in+vitro+and+in+vivo.">Beta amyloid angiogenic activity in vitro and in vivo.</a> Int J Mol Med. 19 (4), 581-587 (2007).</li><li>Paris, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impaired+angiogenesis+in+a+transgenic+mouse+model+of+cerebral+amyloidosis.">Impaired angiogenesis in a transgenic mouse model of cerebral amyloidosis.</a> Neurosci Lett. 366 (1), 80-85 (2004).</li><li>Kitaguchi, H., Ihara, M., Saiki, H., Takahashi, R., Tomimoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capillary+beds+are+decreased+in+Alzheimer's+disease,+but+not+in+Binswanger's+disease.">Capillary beds are decreased in Alzheimer's disease, but not in Binswanger's disease.</a> Neurosci Lett. 417 (2), 128-131 (2007).</li><li>Jantaratnotai, N., Ryu, J. K., Schwab, C., McGeer, P. L., McLarnon, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Vascular+Perturbations+in+an+Abeta-Injected+Animal+Model+and+in+AD+Brain.">Comparison of Vascular Perturbations in an Abeta-Injected Animal Model and in AD Brain.</a> Int J Alzheimers Dis. 2011, 918280 (2011).</li><li>Donnini, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Abeta+peptides+accelerate+the+senescence+of+endothelial+cells+in+vitro+and+in+vivo,+impairing+angiogenesis.">Abeta peptides accelerate the senescence of endothelial cells in vitro and in vivo, impairing angiogenesis.</a> FASEB J. 24 (7), 2385-2395 (2010).</li><li>Tai, L. M., Holloway, K. A., Male, D. K., Loughlin, A. J., Romero, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid-beta-induced+occludin+down-regulation+and+increased+permeability+in+human+brain+endothelial+cells+is+mediated+by+MAPK+activation.">Amyloid-beta-induced occludin down-regulation and increased permeability in human brain endothelial cells is mediated by MAPK activation.</a> J Cell Mol Med. 14 (5), 1101-1112 (2010).</li><li>Tai, L. M., Loughlin, A. J., Male, D. K., Romero, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P-glycoprotein+and+breast+cancer+resistance+protein+restrict+apical-to-basolateral+permeability+of+human+brain+endothelium+to+amyloid-beta.">P-glycoprotein and breast cancer resistance protein restrict apical-to-basolateral permeability of human brain endothelium to amyloid-beta.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1079-1083 (2009).</li><li>Tai, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarized+P-glycoprotein+expression+by+the+immortalised+human+brain+endothelial+cell+line,+hCMEC/D3,+restricts+apical-to-basolateral+permeability+to+rhodamine+123.">Polarized P-glycoprotein expression by the immortalised human brain endothelial cell line, hCMEC/D3, restricts apical-to-basolateral permeability to rhodamine 123.</a> Brain Res. 1292, 14-24 (2009).</li><li>Koster, K. P., Thomas, R., Morris, A. W., Tai, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+prevents+oligomeric+amyloid-beta+induced+angiogenesis+deficits+in+vitro.">Epidermal growth factor prevents oligomeric amyloid-beta induced angiogenesis deficits in vitro.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 36 (11), 1865-1871 (2016).</li><li>Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+hCMEC/D3+cell+line+as+a+model+of+the+human+blood+brain+barrier.">The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier.</a> Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).</li><li>Weksler, B. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier-specific+properties+of+a+human+adult+brain+endothelial+cell+line.">Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line.</a> FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).</li><li>Welser-Alves, J. V., Boroujerdi, A., Milner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+primary+mouse+brain+endothelial+cells.">Isolation and culture of primary mouse brain endothelial cells.</a> Methods Mol Biol. 1135, 345-356 (2014).</li><li>Dahlgren, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligomeric+and+fibrillar+species+of+amyloid-beta+peptides+differentially+affect+neuronal+viability.">Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability.</a> J Biol Chem. 277 (35), 32046-32053 (2002).</li><li>Carpentier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Angiogenesis+Analyzer.">Angiogenesis Analyzer.</a> ImageJ News. , (2012).</li><li>Thomas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+growth+factor+prevents+APOE4+and+amyloid-beta-induced+cognitive+and+cerebrovascular+deficits+in+female+mice.">Epidermal growth factor prevents APOE4 and amyloid-beta-induced cognitive and cerebrovascular deficits in female mice.</a> Acta Neuropathol Commun. 4 (1), 111 (2016).</li><li>Tai, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+APOE+in+cerebrovascular+dysfunction.">The role of APOE in cerebrovascular dysfunction.</a> Acta Neuropathol. 131 (5), 709-723 (2016).</li><li>Ambrose, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroangiogenesis:+a+vascular+basis+for+Alzheimer's+disease+and+cognitive+decline+during+aging.">Neuroangiogenesis: a vascular basis for Alzheimer's disease and cognitive decline during aging.</a> J Alzheimers Dis. 32 (3), 773-788 (2012).</li><li>Ambrose, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+therapeutic+approach+for+senile+dementias:+neuroangiogenesis.">A therapeutic approach for senile dementias: neuroangiogenesis.</a> J Alzheimers Dis. 43 (1), 1-17 (2015).</li><li>Ambrose, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Capillaries+in+the+Lesser+Ailments+of+Old+Age+and+in+Alzheimer's+Disease+and+Vascular+Dementia:+The+Potential+of+Pro-Therapeutic+Angiogenesis.">The Role of Capillaries in the Lesser Ailments of Old Age and in Alzheimer's Disease and Vascular Dementia: The Potential of Pro-Therapeutic Angiogenesis.</a> J Alzheimers Dis. 54 (1), 31-43 (2016).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השיטות המתוארות ניתן להשתמש כדי לענות על כמה שאלות ביולוגיות היסוד סביב כיסוי המוחי 24 . באופן ספציפי, הם יכולים לזהות אילו קולטנים מסלולי איתות לשחק תפקיד אנגיוגנזה, כיסוי כלי הדם ברקמת סרטן, ותאי האנדותל היקפיים הרלוונטיים למוח. הדוגמאות כוללות קולטני ?...

<html> מחסום דם מוח (BBB) ​​של נימים מוחיים הוא הממשק הגדול ביותר של מגע בין דם למוח וממלא תפקיד מרכזי בהומיאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית (CNS) 1 , 2 . תהליכים דינמיים ב- BBB מונעים את ספיגה של מולקולות לא רצויות מהדם, מסירים את מוצרי הפסולת מה- CNS, מספקים חומרים מזינים חיוניים ומולקולות איתות ל- CNS, ומווסתים את הנוירו-דלקתיות 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . נזקי BBB נפוצים במהלך ההזדקנות וכמה הפרעות ניווניות כולל מחלת אלצהיימר (AD), טרשת נפוצה ושבץ 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,התחת = &quot;xref&quot;&gt; 6. לכן, תפקוד לקוי של BBB עשוי למלא תפקיד מפתח בהפרעות נוירודגנרטיביות, כולל כמטרה טיפולית. שמירה על כיסוי כלי חשוב עבור פונקציות homeostatic של BBB. עם זאת, in vivo ו במבחנה נתונים הסכסוך על אם התהליכים המעורבים הפרעות נוירודגנרטיב לגרום כיסוי BBB גבוה או נמוך יותר 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , במיוחד לספירה. לכן, יש רציונל חזק לפיתוח של מודלים במבחנה באמצעות סוגי תאים רלוונטיים כדי להעריך באופן מקיף יותר להבין את הדינמיקה של כיסוי BBB. נימים מוחיים מורכבים אסטרוציטים, pericytes ותאי האנדותל במוח (BECs) <sUp class = &quot;xref&quot;&gt; 3. כל סוגי התאים לתרום את הפונקציה של BBB באמצעות תמיכה מבנית ועל ידי הפרשת המולקולות מפעיל כגון גורמי גדילה אנגיוגניים, ציטוקינים chemokines הפועלים באופרה paracrine ו אוטוקרינית. עם זאת, התאים העיקריים אפקטור של BBB הם BECs 3 . באופן כללי, טכניקות תא התרבות להערכת פונקציה BBB הן מבחני חדירות המבוצעת על תאים הגדלים על מסננים מוסיף, או הערכת רמות של חלבונים BEC מפתח, הן לאחר תוספת של לחצים 14 , 15 , 16 . למרות חשוב, מבחני אלה אינם מתמקדים כיסוי המוח. הנה, השיטות הקודמות שלנו 17 מפורטים כדי להעריך כיסוי BEC ומבנים דמויי רשת כמו באמצעות תרבויות יחיד של BECs האדם הנציח, תרבויות יחיד של BECs העכבר הראשי, תרבות משולשת אנושית(BECs, astrocytes ו pericytes) של BBB. המטרה היתה להדגים את ההשפעה המזיקה של OAβ, הנחשב תורם חשוב להתקדמות AD, על כיסוי BEC. האפקט המגן של גורם הצמיחה באפידרמיס (EGF) מדגיש את הפוטנציאל של הטכניקה ככלי סינון טיפולי. טכניקה זו כוללת מספר יישומים נרחבים למחקר בסיסי ויישומי, כולל:) 1 הגדרת תפקידם של מסלולים ספציפיים באנגיוגנזה וכיסוי כלי שיט,) 2 הערכת ההשפעות של מחלות וגורמים רלוונטיים להזדקנות על אנגיוגנזה ועל כיסוי כלי, 3) זיהוי תרופתי מטרות.

<table><tbody><tr><td>hCMEC/D3 cells</td><td>Milipore</td><td>SCC066</td><td></td></tr><tr><td>EBM-2 basal media</td><td>Lonza</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type 1</td><td>ThermoFisher</td><td>A1064401</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, calcium, magnesium, no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red</td><td>ThermoFisher</td><td>14175095</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%)</td><td>ThermoFisher</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>5% FBS</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>10% Ascorbic acid</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>10% Gentamycin sulphate</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>25% Hydrocortisone</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor</td><td>Lonza</td><td>CC-4147</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin hydrochloride</td><td>VWR</td><td>80503-312</td><td></td></tr><tr><td>MEM-HEPES</td><td>Thermo Scientific</td><td>12360-038</td><td></td></tr><tr><td>Papain cell dissociation system (papain and DNase1)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Human pericytes</td><td>Sciencell</td><td>1200</td><td></td></tr><tr><td>Pericyte basal media</td><td>Sciencell</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>Pericyte growth supplement</td><td>Sciencell</td><td>1252</td><td></td></tr><tr><td>Human Astrocytes</td><td>Sciencell</td><td>1800</td><td></td></tr><tr><td>Astrocyte media</td><td>Sciencell</td><td>1801</td><td></td></tr><tr><td>Astrocyte growth supplement</td><td>Sciencell</td><td>1852</td><td></td></tr><tr><td>Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced)</td><td>Corning</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Angiogenesis m-plates (96-well)</td><td>ibidi</td><td>89646</td><td></td></tr><tr><td>Human Epidermal growth factor</td><td>Shenendoah Biotechnology</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker green</td><td>ThermoFisher</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker orange</td><td>ThermoFisher</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker blue</td><td>ThermoFisher</td><td>C2110</td><td></td></tr><tr><td>Poly-l-lysine</td><td>Sciencell</td><td>0403</td><td></td></tr><tr><td>10% Neutral Buffered Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT5012-60ML</td><td></td></tr><tr><td>C57BL mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>na</td><td></td></tr><tr><td>PCR tube strips</td><td>GeneMate</td><td>T-3014-2</td><td></td></tr><tr><td>Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope</td><td>Zeiss</td><td>na</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro assays to assess blood-brain barrier mesh-like vessel formation and disruption

מחסום דם מוחי (BBB) ​​מכסה תפקיד מרכזי בהומיאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית (CNS). BBB מתוחזק באופן דינמי על ידי האסטרוציטים, pericytes ותאי האנדותל במוח (BECs). כאן, אנו מפרטים שיטות להעריך כיסוי BBB באמצעות תרבויות יחיד של BECs האדם הנציח, תרבויות יחיד של BECs העכבר הראשי, ואת מודל התרבות משולש אנושית (BECs, astrocytes ו pericytes) של BBB. כדי להדגיש את הישימות של מבחני למדינות מחלה, אנו מתארים את ההשפעה של olylomeric amyloid-β (oAβ), שהוא תורם חשוב להתפתחות אלצהיימר (AD) התקדמות, על כיסוי BBB. יתר על כן, אנו מנצלים את גורם הצמיחה באפידרמיס (EGF) כדי להאיר את פוטנציאל ההקרנה של התרופה של הטכניקות. התוצאות שלנו מראים כי BECs מתורבת יחיד יחיד משולש ליצור מבנים דמויי רשת כמו בתנאים הבסיסיים, וכי oAβ משבש את זה מבנה התא meshwork ו degenerates מבני רשת preformed,אבל EGF חוסם את ההפרעה הזאת. לכן, הטכניקות המתוארות חשובות לנתח תהליכים בסיסיים וחולי רלוונטיים המווסתים את כיסוי ה- BBB.

בתרבויות בודדות, הן hCMEC / D3 תאים ( איור 3 א ) ואת BECs העכבר הראשי ( איור 3 ב ) טופס מבנים דמויי רשת כמו בכל רחבי הבאר. המבנים מאופיינים על ידי רשת של צמתים interlinked ( איור 3 ). בכל הפרדיגמות המתוארות ( אי...

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption at JoVE.com

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

שמירה על כיסוי מחסום דם מוחי היא המפתח להומיאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתאר טכניקות חוץ גופית כדי לתמצת את התהליכים הבסיסיים הפתולוגיים כי לווסת דם מוח המכשול הכיסוי.

ב מבחני מבחנה כדי להעריך דם מוח מחסום כמו רשת כלי שיטפון ושיבוש

Blood-brain barrier (BBB) coverage plays a central role in the homeostasis of the central nervous system (CNS). The BBB is dynamically maintained by ...

in-vitro-assays-to-assess-blood-brain-barrier-mesh-like-vessel

Research

JoVE Journal

Medicine

In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

8.4K Views.  University of Illinois at Chicago.  שמירה על כיסוי מחסום דם מוחי היא המפתח להומיאוסטזיס של מערכת העצבים המרכזית. פרוטוקול זה מתאר טכניקות חוץ גופית כדי לתמצת את התהליכים הבסיסיים הפתולוגיים כי לווסת דם מוח המכשול הכיסוי. 

Video: In Vitro Assays to Assess Blood-brain Barrier Mesh-like Vessel Formation and Disruption

Predicting In Vivo Payloads Delivery using a Blood-brain Tumor-barrier in a Dish

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of brain tumors, the molecular selectivity of BBB also shields the neoplastic cells by blocking the delivery of peripherally administered chemotherapies. The development of novel drugs (including nanoparticles) targeting malignant brain tumors ideally requires the use of preclinical animal models to study the drug&#8217;s transcytosis and antitumor efficacy. In order to comply with the 3R principle (refine, reduce, and replace) to reduce the number of laboratory animals in experimental setup and perform the high-throughput screening of a large library of antitumor agents, we developed a reproducible in vitro human and murine mimic of the blood-brain tumor-barrier (BBTB) using three-layered cultures of endothelial cells, astrocytes, and patient-derived glioblastoma spheres. For higher scalability and reproducibility, commercial cell lines or immortalized cells have been used in tailored conditions to allow the formation of a barrier resembling the actual BBB. Here we describe a protocol to obtain a BBTB mimic by culturing endothelial cells in contact with astrocytes at specific cell densities on inserts. This BBTB mimic can be used, for instance, for the quantification and confocal imaging of the nanoparticle passage through the endothelial and astrocytic barriers, in addition to the evaluation of the tumor cell targeting within the same assay. Moreover, we show that the obtained data can be used to predict the behavior of nanoparticles in preclinical animal models. In a broader perspective, this in vitro model could be adapted to other neurodegenerative diseases for the determination of the passage of new therapeutic molecules through the BBB and/or be supplemented with brain organoids to directly evaluate the efficacy of drugs.

Drug targeting to central nervous system tumors is a major challenge. Here we describe a protocol to produce an in vitro mimic of the blood-brain tumor-barrier using murine and/or human cells and discuss their relevance for the predictability of central nervous system tumor targeting in vivo.

Predicting ב Vivo מטענים משלוח באמצעות הגידול-מחסום דם-מוח בקערה

Highly selective by nature, the blood-brain barrier (BBB) is essential for the brain homeostasis in physiological conditions. However, in the context of ...

Cancer Research

Improved Method for the Preparation of a Human Cell-based, Contact Model of the Blood-Brain Barrier

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has been implied in the etiology of many brain pathologies, creating a need for development of human in vitro BBB models to assist in clinically-relevant research. Among the numerous BBB models thus far described, a static (without flow), contact BBB model, where astrocytes and brain endothelial cells (BECs) are cocultured on the opposite sides of a porous membrane, emerged as a simplified yet authentic system to simulate the BBB with high throughput screening capacity. Nevertheless the generation of such model presents few technical challenges. Here, we describe a protocol for preparation of a contact human BBB model utilizing a novel combination of primary human BECs and immortalized human astrocytes. Specifically, we detail an innovative method for cell-seeding on inverted inserts as well as specify insert staining techniques and exemplify how we use our model for BBB-related research.

Establishment of human models of the blood-brain barrier (BBB) can benefit research into brain conditions associated with BBB failure. We describe here an improved technique for preparation of a contact BBB model, which permits coculturing of human astrocytes and brain endothelial cells on the opposite sides of a porous membrane.

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

The blood-brain barrier (BBB) comprises impermeable but adaptable brain capillaries which tightly control the brain environment. Failure of the BBB has ...

Bioengineering

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier (BBB): A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and characterize a highly reproducible rat syngeneic in vitro model of the BBB using co-cultures of primary rat brain endothelial cells (RBEC) and astrocytes to study receptors involved in transcytosis across the endothelial cell monolayer. Astrocytes were isolated by mechanical dissection following trypsin digestion and were frozen for later co-culture. RBEC were isolated from 5-week-old rat cortices. The brains were cleaned of meninges and white matter, and mechanically dissociated following enzymatic digestion. Thereafter, the tissue homogenate was centrifuged in bovine serum albumin to separate vessel fragments from nervous tissue. The vessel fragments underwent a second enzymatic digestion to free endothelial cells from their extracellular matrix. The remaining contaminating cells such as pericytes were further eliminated by plating the microvessel fragments in puromycin-containing medium. They were then passaged onto filters for co-culture with astrocytes grown on the bottom of the wells. RBEC expressed high levels of tight junction (TJ) proteins such as occludin, claudin-5 and ZO-1 with a typical localization at the cell borders. The transendothelial electrical resistance (TEER) of brain endothelial monolayers, indicating the tightness of TJs reached 300 ohm&#183;cm2 on average. The endothelial permeability coefficients (Pe) for lucifer yellow (LY) was highly reproducible with an average of 0.26 &#177;&#160;0.11 x 10-3 cm/min. Brain endothelial cells organized in monolayers expressed the efflux transporter P-glycoprotein (P-gp), showed a polarized transport of rhodamine 123, a ligand for P-gp, and showed specific transport of transferrin-Cy3 and DiILDL across the endothelial cell monolayer. In conclusion, we provide a protocol for setting up an in vitro BBB model that is highly reproducible due to the quality assurance methods, and that is suitable for research on BBB transporters and receptors.

Setting-up an In Vitro Model of Rat Blood-brain Barrier BBB: A Focus on BBB Impermeability and Receptor-mediated Transport

The aim of the present study was to validate the reproducibility of an in vitro BBB model involving a rat syngeneic co-culture of endothelial cells and astrocytes. The endothelial cell monolayer presented high TEER and low LY permeability. Expression of specific TJ proteins, functional responses to inflammation and functionality of transporters and receptors were assessed.

הגדרה למעלה<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם מוח חולדה (BBB): פוקוס על BBB האטים ותחבורה בתיווך קולטן

The blood brain barrier (BBB) specifically regulates molecular and cellular flux between the blood and the nervous tissue. Our aim was to develop and ...

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). This process is characterized by the transmigration of activated T cells across brain endothelial cells (ECs), the main constituents of the BBB. However, the consequences on brain EC function upon interaction with such T cells are largely unknown. Here we describe an assay that allows for the evaluation of primary mouse brain microvascular EC (MBMEC) function and barrier integrity during the interaction with T cells over time. The assay makes use of impedance cell spectroscopy, a powerful tool for studying EC monolayer integrity and permeability, by measuring changes in transendothelial electrical resistance (TEER) and cell layer capacitance (Ccl). In direct contact with ECs, stimulated but not na&#239;ve T cells are capable of inducing EC monolayer dysfunction, as visualized by a decrease in TEER and an increase in Ccl. The assay records changes in EC monolayer integrity in a continuous and automated fashion. It is sensitive enough to distinguish between different strengths of stimuli and levels of T cell activation and it enables the investigation of the consequences of a targeted modulation of T cell-EC interaction using a wide range of substances such as antibodies, pharmacological reagents and cytokines. The technique can also be used as a quality control for EC integrity in in vitro T-cell transmigration assays. These applications make it a versatile tool for studying BBB properties under physiological and pathophysiological conditions.

An In Vitro Model of the Blood-brain Barrier Using Impedance Spectroscopy: A Focus on T Cell-endothelial Cell Interaction

Here, we describe an in vitro murine model of the blood-brain barrier that makes use of impedance cell spectroscopy, with a focus on the consequences on endothelial cell integrity and permeability upon interaction with activated T cells.

<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום דם-מוח באמצעות ספקטרוסקופיית עכבה: התמקדות T Cell-אנדותל אינטראקציה תא

Breakdown of the blood-brain barrier (BBB) is a critical step in the development of autoimmune diseases such as multiple sclerosis (MS) and its animal ...

Immunology and Infection

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte extravasation might result in pathophysiological changes in the CNS. Thus, investigation of lymphocyte migration into the CNS is important to understand inflammatory CNS diseases and to develop new therapy approaches. Here we present an in vitro model of the human blood-brain barrier to study lymphocyte extravasation. Human brain microvascular endothelial cells (HBMEC) are confluently grown on a porous polyethylene terephthalate transwell insert to mimic the endothelium of the blood-brain barrier. Barrier function is validated by zonula occludens immunohistochemistry, transendothelial electrical resistance (TEER) measurements as well as analysis of evans blue permeation. This model allows investigation of the diapedesis of rare lymphocyte subsets such as CD56brightCD16dim/- NK cells. Furthermore, the effects of other cells, cytokines and chemokines, disease-related alterations, and distinct treatment regimens on the migratory capacity of lymphocytes can be studied. Finally, the impact of inflammatory stimuli as well as different treatment regimens on the endothelial barrier can be analyzed.

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Here, we describe a human blood-brain barrier model enabling to investigate lymphocyte transmigration into the central nervous system in vitro.

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של מחסום אנושי דם-מוח

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

In Vivo מחסום הדם - מוח חדירות Assay בעכברים באמצעות Fluorescently עם התווית המשדרים

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

Neuroscience

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) models based on pBECs in mono-culture (MC), MC with astrocyte-conditioned medium (ACM), and non-contact co-culture (NCC) with astrocytes of porcine or rat origin. pBECs were isolated and cultured from fragments of capillaries from the brain cortices of domestic pigs 5-6 months old. These fragments were purified by careful removal of meninges, isolation and homogenization of grey matter, filtration, enzymatic digestion, and centrifugation. To further eliminate contaminating cells, the capillary fragments were cultured with puromycin-containing medium. When 60-95% confluent, pBECs growing from the capillary fragments were passaged to permeable membrane filter inserts and established in the models. To increase barrier tightness and BBB characteristic phenotype of pBECs, the cells were treated with the following differentiation factors: membrane permeant 8-CPT-cAMP (here abbreviated cAMP), hydrocortisone, and a phosphodiesterase inhibitor, RO-20-1724 (RO). The procedure was carried out over a period of 9-11 days, and when establishing the NCC model, the astrocytes were cultured 2-8 weeks in advance. Adherence to the described procedures in the protocol has allowed the establishment of endothelial layers with highly restricted paracellular permeability, with the NCC model showing an average transendothelial electrical resistance (TEER) of 1249 &#177; 80 &#937; cm2, and paracellular permeability (Papp) for Lucifer Yellow of 0.90 10-6 &#177; 0.13 10-6 cm sec-1 (mean &#177; SEM, n=55). Further evaluation of this pBEC phenotype showed good expression of the tight junctional proteins claudin 5, ZO-1, occludin and adherens junction protein p120 catenin. The model presented can be used for a range of studies of the BBB in health and disease and, with the highly restrictive paracellular permeability, this model is suitable for studies of transport and intracellular trafficking.

Improved Method for the Establishment of an In Vitro Blood-Brain Barrier Model Based on Porcine Brain Endothelial Cells

The aim of the protocol is to present an optimized procedure for the establishment of an in vitro blood-brain barrier (BBB) model based on primary porcine brain endothelial cells (pBECs). The model shows high reproducibility, high tightness, and is suitable for studies of transport and intracellular trafficking in drug discovery.

שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

The aim of this protocol presents an optimized procedure for the purification and cultivation of pBECs and to establish in vitro blood-brain barrier (BBB) ...

מודל מחסום דם-מוח תלת-ממדי המופק מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

Reconstruction of the Blood-Brain Barrier In Vitro to Model and Therapeutically Target Neurological Disease

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting the brain from pathogens. The inherent barrier properties of the BBB pose a challenge for therapeutic drug delivery into the CNS to treat neurological diseases. Impaired BBB function has been related to neurological disease. Cerebral amyloid angiopathy (CAA), the deposition of amyloid in the cerebral vasculature leading to a compromised BBB, is a co-morbidity in most cases of Alzheimer&#39;s disease (AD), suggesting that BBB dysfunction or breakdown may be involved in neurodegeneration. Due to limited access to human BBB tissue, the mechanisms that contribute to proper BBB function and BBB degeneration remain unknown. To address these limitations, we have developed a human pluripotent stem cell-derived BBB (iBBB) by incorporating endothelial cells, pericytes, and astrocytes in a 3D matrix. The iBBB self-assembles to recapitulate the anatomy and cellular interactions present in the BBB. Seeding iBBBs with amyloid captures key aspects of CAA. Additionally, the iBBB offers a flexible platform to modulate genetic and environmental factors implicated in cerebrovascular disease and neurodegeneration, to investigate how genetics and lifestyle affect disease risk. Finally, the iBBB can be used for drug screening and medicinal chemistry studies to optimize therapeutic&#160;delivery to the CNS. In this protocol, we describe the differentiation of the three types of cells (endothelial cells, pericytes, and astrocytes) arising from human pluripotent stem cells, how to assemble the differentiated cells into the iBBB, and how to model CAA in vitro using exogenous amyloid. This model overcomes the challenge of studying live human brain tissue with a system that has both biological fidelity and experimental flexibility, and enables the interrogation of the human BBB and its role in neurodegeneration.

מחבר זרקור: גישה מותאמת אישית לחקר מחלת אלצהיימר באמצעות מודל מחסום דם-מוח במבחנה 

The blood-brain barrier (BBB) has a crucial role in sustaining a stable and healthy brain environment. BBB dysfunction is associated with many neurological diseases. We have developed a 3D, stem-cell-derived model of the BBB to investigate cerebrovascular pathology, BBB integrity, and how the BBB is altered by genetics and disease.

שחזור מחסום הדם-מוח במבחנה כדי למדל ולטפל במחלות נוירולוגיות

The blood-brain barrier (BBB) is a key physiological component of the central nervous system (CNS), maintaining nutrients, clearing waste, and protecting ...

ב מבחני מבחנה כדי להעריך דם מוח מחסום כמו רשת כלי שיטפון ושיבוש

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Predicting ב Vivo מטענים משלוח באמצעות הגידול-מחסום דם-מוח בקערה

שיפר שיטה להכנה מבוססת תאים, דגם מגע אנושי של מחסום דם המוח

הגדרה למעלה

ניתוח של לימפוציטים extravasation שימוש

In Vivo מחסום הדם - מוח חדירות Assay בעכברים באמצעות Fluorescently עם התווית המשדרים

שיפור שיטה להקמת במבחנה מחסום הדם - מוח מודל המבוסס על תאי אנדותל המוח חזירי

שחזור מחסום הדם-מוח במבחנה כדי למדל ולטפל במחלות נוירולוגיות

שחזור מחסום הדם-מוח במבחנה כדי למדל ולטפל במחלות נוירולוגיות

שחזור מחסום הדם-מוח במבחנה כדי למדל ולטפל במחלות נוירולוגיות