이 비디오에서는 쥐 뇌 미토콘드리아를 체외 생물학적 모델로 사용하여 멤브레인 수준에서 아밀로이드 독성 메커니즘에 대한 모델 연구를 설명합니다. 인지질 모델 시스템의 아밀로이드 골재에 의한 멤브레인 변투기 메커니즘을 설명하는 보고서를 축적했음에도 불구하고 생물학적 막 개발에서 시작되는 사건을 직접 대상으로 연구했습니다. 본 영상에서는 쥐 뇌 미토콘드리아 막을 체외 생물학적 모델로 분석하는 알파 시뉴클레인의 아밀로이드 피브릴을 설명한다.
우리는 잘 특징적인 막을 가진 세포기관으로 미토콘드리아가 신경 퇴행성 질환과 관련되었던 막 수준에서 아밀로이드 세포 독성의 기계장치에 관련되었던 분자 연구 결과를 위한 매우 유용한 생물학 모형 시스템을 제공할 수 있다고 믿습니다. 작은 동물 기요틴으로 쥐를 참수하고 미토콘드리아 특성의 가능한 악화를 제한하기 위해 쥐의 참수 1 분 이내에 규모에서 뇌를 제거합니다. 신속하게 작업하고 절차 전반에 걸쳐 얼음에 모든 것을 유지하는 것이 중요합니다.
격리 완충제의 30 밀리리터로 조직을 두 번 씻으시다. 차가운 격리 버퍼를 포함하는 비커로 옮기고 가위로 뇌를 잘게 다진다. 조직 현탁액을 20 밀리리터 감기 로 전송하는 균질화.
전동 유봉으로 9개의 상하 스트로크를 사용하여 조직 조각을 균질화합니다. 균질화가 차가운 상태로 유지되도록 3개의 균질화 스트로크의 각 세트 후에 약 30 초 동안 얼음에 혼합물을 둡니다. 동종포를 미리 냉각된 원심분리기 튜브와 원심분리기로 1, 300G에서 3분간 4시그레이드로 옮긴다.
상체를 조심스럽게 데칭하고 미리 차가운 원심분리기 튜브로 옮춥니다. 10 분 동안 4 센티미터에서 21, 000 G의 원심 분리기. 피펫으로 혼합물을 부드럽게 저어서 상체를 버리고 밀도 그라데이션 매체에서 펠릿을 다시 놓습니다.
30, 700 G의 고정 각도 로터의 원심분리기는 5분 동안 4센티미터의 700G입니다. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 상단에 축적된 재료의 날카로운 끝을 제거하여 대부분 미엘린을 함유합니다. 미토콘드리아 분획에 8밀리리터 절연 버퍼를 넣고 파이펫으로 혼합물을 부드럽게 저어줍니다.
16, 700 G의 원심분리기는 4가지 섭씨에서 10분 동안. 상체를 조심스럽게 제거하고 바닥느슨한 펠릿을 방해받지 않고 남깁니다. 밀리리터 지방산이 없는 BSA당 1밀리리터 10밀리그램을 원심분리기 튜브에 넣고 파이펫 끝으로 혼합물을 부드럽게 저어줍니다.
격리 버퍼를 추가하여 볼륨을 5밀리리터로 구성합니다. 10 분 동안 4 센티미터에서 6, 900 G의 원심 분리기. 이것은 단단한 펠릿을 생성해야합니다.
상류제를 데칭하고 미토콘드리아 펠릿을 격리 버퍼로 부드럽게 재보펜합니다. 미토콘드리아 균주를 냉정한 절연 완충제로 밀리리터 당 1밀리그램으로 희석하고 튜브 당 미토콘드리아 의 195 마이크로리터인 1.5 밀리리터 튜브에 배치합니다. 볼륨 트리톤 X-100당 5개의 마이크로리터 20%를 최대 효소 활성을 위한 긍정적인 제어로 한 튜브에 20%의 마이크로리터를 추가하고 5개의 마이크로리터 디온화된 물을 다른 튜브에 추가하여 교반기와 혼합합니다.
30 센트그레이드로 설정된 따뜻한 수조에서 튜브를 10분 동안 배양합니다. 펠릿 미토콘드리아는 16, 000 G 4 섭씨에서 고정 된 각도 로터에서 튜브의 원심 분리에 의해 15 분 동안. 다음 부분에 설명된 표준 분광광분석 분석법을 사용하여 미토콘드리아 황량제 탈수소효소의 활성을 평가하기 위한 결과 슈퍼나츠를 신중하게 수집한다.
다음과 같이 미토콘드리아 막의 무결성을 계산합니다. malate 탈수소 효소 활동 결정의 경우, 파이펫 890 및 880 마이크로리터 50 밀리머 트리-HCL 버퍼를 블랭크 및 샘플 테스트 큐벳으로 각각 100 마이크로리터 50 밀리머 옥살로아세테이트와 10 밀리머 베타-NADH의 10 마이크로리터가 뒤따랐다. 큐벳을 분광광계에 넣고 빈 에 대한 참조를 넣습니다.
10 마이크로리터 미토콘드리아 균질을 밀리리터당 1밀리그램을 첨가하여 큐벳을 샘플링합니다. 즉시 반전으로 섞습니다. NADH 산화로 인한 흡광도의 기록적인 감소는 1분 동안 340나노미터로 감소하였다.
알파 시뉴클레인 아밀로이드 세동을 위해, 단백질 용액 294 마이크로리터, 각 1.5 밀리리터 튜브에 200 마이크로몰어를 추가하십시오. 그런 다음 6 개의 마이크로 리터 ThT 용액 1 밀리머를 추가합니다. 800 RPM에서 일정한 교반에서 37 Centigrade에서 솔루션을 혼합하고 thermomixer에 튜브를 인큐베이션합니다.
소 인슐린 아밀로이드 세동의 경우 단백질 용액 637 마이크로리터, 250 마이크로몰라를 1.5 밀리리터 튜브에 추가하십시오. 그런 다음 13 마이크로 리터 ThT 용액 을 넣고 1 밀리머를 넣고 교반합니다. 투명한 하단 96웰 플레이트의 각 웰에 알리코트 200 마이크로리터의 단백질 용액을 추가합니다.
수정처럼 맑은 밀봉 테이프로 접시를 밀봉합니다. 플레이트를 Cytation 5 형광 판 판독기에 적재합니다. 12시간 동안 30분 간격으로 ThT 형광을 측정합니다.
440 나노미터에서 여기를 사용하고 485 나노 미터에서 배출하십시오. 우물을 선택합니다. 각 측정 전에 5초 동안 접시를 흔들어 줍니다.
동요없이 57 섭씨에서 온도를 설정합니다. 미토콘드리아 균질화를 함유한 1.5밀리리터 튜브 2시리즈, MDH 방출 분석용 시리즈 및 미토콘드리아 ROS 측정을 위한 시리즈 1시리즈를 준비한다. 알파 시뉴클레인, 소 인슐린 또는 암탉 달걀 흰 자개미의 신선하거나 아밀로이드 피브릴을 미토콘드리아 균질에 넣고 부드럽게 파이펫팅합니다.
30 센트리그레이드로 설정된 따뜻한 수조에서 미토콘드리아 현탁액을 30분 동안 포함하는 인큐베이터 튜브. 말린 탈수소 효소 방출 분석의 경우 원심분리기는 16, 000 G에서 15분 동안 유동균성을 배양합니다. 프로토콜 섹션 4부에 설명된 바와 같이 미토콘드리아 MDH의 활성을 속이는 결과 초월제를 신중하게 수집한다.
MDH 릴리스를 다음과 같이 계산합니다. 미토콘드리아 ROS 측정을 위해, 96웰 플레이트의 각 웰에 배양된 미토콘드리아 균주형의 파이펫 191 마이크로리터. 50 마이크로 몰라 DCFDA의 4 마이크로 리터를 추가합니다.
그런 다음 200 밀리머의 5 마이크로 리터를 간결하게 추가합니다. 접시를 30분간 배양하여 30센티미터로 설정하고 부드럽게 저어줍니다. 플레이트를 Cytation 5 형광 플레이트 판독기에 적재하고 프로토콜 섹션에 따라 형광 강도를 측정합니다.
미토콘드리아 막 무결성은 트리톤 X-100에 의한 막 중단 및 효소 방출 전후에 격리된 미토콘드리아에서MDH 활성을 측정하여 평가하였다. 보시다시피, 우리는 일반적으로 미토콘드리아 제제가 약 93%가 그대로 있다는 것을 발견했습니다. ThT 형광 분석은 아밀로이드 피브릴의 성장을 모니터링하기 위해 수행되었다.
3개의 단백질의 아밀로이드 세동을 위한 곡선은 알파-시뉴클레인, 소 인슐린 및 암탉 달걀 흰자수에 대해 각각 약 96, 12 및 96시간의 고원에 도달하는 전형적인 시그로이드 패턴을 보였으며, AFM 측정에 의해 더 확인된 아밀로이드 피브릴의 형성을 시사하였다. 아밀로이드 피브릴에 의한 미토콘드리아 막의 가능한 투과화 및 손상은 미토콘드리아 MDH 및 미토콘드리아 ROS 측정의 방출에 의해 조사되었다. 왼쪽 그래프에서 볼 수 있듯이, 미토콘드리아에 알파-시뉴클레인 아밀로이드 피브릴을 첨가하면 MDH의 실질적인 방출이 관찰되었다.
인슐린 피브릴에 의해 약간의 방출이 검출되었지만, 암탉 달걀 흰자 리소지메 피브릴은 효과가 없는 것으로 나타났습니다. 오른쪽 그래프는 미토콘드리아 ROS 함량에 아밀로이드 피브릴의 효과를 보여줍니다. 미토콘드리아 ROS에서 유의한 개선은 암탉 계란 흰자 리소지메 또는 인슐린 아밀로이드 피브릴을 첨가한 후 관찰되었지만, 알파 시뉴클레인 피브릴로 치료하여 뇌 미토콘드리아의 ROS 함량이 현저증가했습니다.
본 비디오는 막 수준에서 비골 골체 세포 독성의 메커니즘에 대한 모델 연구를 설명, 다양한 단백질에서 발생하는 아밀로이드 섬유가 막 손상 및 투과화의 다른 정도를 일으킬 수있는 방법을 보여줍니다. 아밀로이드 피브릴과 그들의 특정 결합 막의 몇몇 주제는 상호 작용하고 막의 불안정하고 후속 동요를 일으키는 원인이 되는 능력을 제공하는 것처럼 보입니다 동안. 이 비디오 후, 당신은 네이티브 형태의 상호 작용을 조사 할 수있을 것입니다, 사전 피브릴라, 다른 펩티드의 성숙한 아밀로이드 섬유와 다른 조직이나 뇌의 다양한 영역에서 분리 미토콘드리아와.
