This work was funded by a grant from the Canadian Institute for Health Research MOP 82890 to SHP. The authors wish to thank G.H. Patterson and J. Lippincott Schwartz for the paGFP construct. SN56 cells were a gift of Dr. Jane Rylett.

1. תא ציפוי וTransfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף תרבית תאים, צלחת ~ 300,000 ל~ 500,000 SN56 תאים (מתנת סוג של ד&quot;ר ג&#39;יין Rylett) על צלחת confocal זכוכית תחתונה 35 מ&quot;מ ולכסות עם תקשורת לפני transfection (הנשר בינוני השתנה Dulbecco, DMEM, בתוספת 10% FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאי הלילה בשעת 37 ° C בחממה של 5% CO 2 להתרבות. הערה: תאים צריכים להיות כ -50% -70% ומחוברות לפני transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף תרבית תאים, תאי transfect עם פלסמידים להביע חלבון פלואורסצנטי מתויגים סמן TGN (transferase Galactosyl מצמידים את חלבון ציאן פלורסנט, גאלט-CFP), חלבון ניאון מתויג סמן תא (כאן, חלבון הליזוזום קשור קרום 1, LAMP1, מתויג עם mRFP), והחלבון של עניין מתויג עם paGFP (βAPP-paGFP). (מבנים אלה בעבר תיארו 30) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים עם מגיב transfection וF פלסמיד דנ&quot;אאו 24 שעות על 37 מעלות צלזיוס ב5% CO 2 באינקובטור. השתמש ביחס ~ 2 מיקרוגרם של ה- DNA ל5 μl של סוכן transfection (למשל Lipofectamine 2000) לרעיל איזון הטוב ביותר ויעילות transfection. ריכוזים בפועל עשויים צריכים להיות מותאמים לפלסמידים שונים. בניסויים שתוארו כאן, להשתמש מיקרוגרם / צלחת 1 confocal של βAPP-paGFP, 0.3 מיקרוגרם / צלחת confocal של LAMP1-mRFP, ושל 0.2 מיקרוגרם / צלחת confocal של גאלט-CFP. הערה: הסכום של פלסמיד המשמש יהיה תלוי ביעילות transfection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשורות תאים עצביות: לאחר שלב 1.4, במכסת מנוע תרבית תאים, להסיר תקשורת מראש transfection ולהבדיל תאי SN56 בDMEM 2 מיליליטר בתוספת 0.1% פניצילין / סטרפטומיצין עם 1 מ&quot;מ dibutyryl AMP המחזורי (dbcAMP) למשך 24 שעות. </li></ol> 2. מיקרוסקופ שלב הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרום חם שנאגרו מלוח פוספט (PBS) ומלח הפתרון מאוזן של האנק (HBSS) עד 37 מעלות צלזיוס. במה מיקרוסקופ חימום לפני imaging עד 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את תאי פעמיים עם PBS, להסיר תקשורת בידול ולהחליף עם 2 מיליליטר של HBSS על 37 מעלות צלזיוס. תאי מקום על הבמה מיקרוסקופ חיממו עד 37 מעלות צלזיוס. הערה: תאי קיימא לכ 1.5-2 שעות בHBSS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר 5-10 דקות לטמפרטורת צלחת confocal לאזן עם הבמה מיקרוסקופ. </li></ol> 3. תמונה-הפעלה של ROIs על Golgi <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם עינית המיקרוסקופ, למצוא תאי transfected עם גאלט-CFP, LAMP1-mRFP, וβAPP-paGFP. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בעדשת נפט טבילה עם הגדלה גבוהה (כלומר 63X או 100X). לקונפורמציה החזותית של הקרינה, להשתמש במסנן להגדיר מסוגלת לדמיין FITC (לCFP וקרינת GFP) וrhodamine (לקרינת mRFP). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את פרוסת confocal עבור כל ערוץ 1 מיקרומטר. קח תמונה ברזולוציה נמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבול לתמונה רק התא של עניין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בכפתור הכוונון, להגדיר באופן ידנימטוס המוקד לאמצע התא. זה בדרך כלל החלק מהתא שבו הגרעין הוא הגדול ביותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצייר 3-5 אזורים מעגליים של עניין (ROIs) בתוך TGN (הקרינה גאלט-CFP). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצייר ROIs (כלומר בתכנית Zeiss LSM), בחר הכפתור &#39;ערוך את ההחזר על ההשקעה &quot;במסוף הפקודה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בלחצן החזר על ההשקעה החוזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ וגרור על גאלט-CFP אזורים חיוביים של התא. שים לב: יש לי חבילות צילום הלבנת עבור מיקרוסקופים רבים יכולת זו. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח תמונה של התא עם ROIs שמעליו. שמור עותק של ROIs לעיון מאוחר יותר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור את ROIs לתמונה, בחר בלחצן &quot;מאקרו&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &quot;טען&quot; כדי להתחיל את &#39;CopyRoisToOverlay&#39; (נתיב קובץ: c: /AIM/Macros/AdvancedTimeSeries/Utility.lvb). הערה: מיקרוסקופ confocal מצויד ב475-525 ננומטר לעבור להקה (CFP) (BP), 500-530 ננומטר BP (GFP),וסטי 560 מסנן מסירה ארוכה (LP) ננומטר נדרשים. לייזר ארגון לננומטר 458 ופליטת 488 ננומטר וליזר HeNe לפליטת 540 ננומטר נדרש גם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מיקרוסקופ לקורס זמן אקונומיקה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את דיודת הלייזר (25 ננומטר לייזר mW 405) לכוח מרבי. זהירות: תמונה-הפעלה מוגזמת עלולה להוביל לצילום רעילות או נזק לקרומים תאיים. השתמש בהגנה על העין כדי למנוע נזק ברשתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מיקרוסקופ 120 מחזורים של הדמיה. הערה: מחזור הדמיה אחת מורכב מהלבנה בתוך ROIs והדמיה של כל התא. זה כמובן זמן אקונומיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את המיקרוסקופ כדי להלבין (צילום הפעל) רק ROIs במשך 20-30 חזרות אחרי כל תמונה. זמן תמונה ואקונומיקת תמונה תשתנה. להגדיר השהיית זמן בין תמונות כל כך כל מחזור הוא כ 30 שניות. הערה: חלק ההדמיה של כל מחזור נמשך כ 15-30 שניות בהתאם לגודל תמונה. ההלבנה עבור כל ROאני הוא כ -50 אלפיות שני. הלבנה של כל 4 ROIs במשך 20 חזרות תיקח 4 שניות בסוף כל מחזור אקונומיקה / תמונה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל את מהלך זמן אקונומיקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את ההלבנה לאחר 15 דקות (30 מחזורים של הדמיה והלבנה), אבל להמשיך בלכידת תמונות של התא. הערה: זמן 0 עד 15 דק &#39;היא התקופה &quot;הדופק&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך לכידת תמונות במשך 45 דקות (ללא הלבנה), לעקוב אחר פינוי βAPP-paGFP. הערה: זמן 15 עד 45 דקות היא התקופה &quot;המרדף&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בשיטת הניתוח שתוארה בשלב 6, שיתוף למקם את החלבון של עניין (כאן, βAPP-paGFP) עם התא של עניין (כאן, LAMP1-mRFP) על ידי ביצוע משטחים לכל ערוץ. </li></ol> 4. לקבוע את התא במורד הזרם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לקבוע אם lysosomes (בניסויים אלה) הוא התא הסופי, להוסיף מעכבי פרוטאז קרום חדיר לחלבונים לגרום לצבור בהליזוזום.<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לβAPP, להשתמש 0.5 מיקרומטר L685, 458 (מעכב γ-secretase הספציפי) לילה או chloroquine 100 מיקרומטר (lysosomes deacidifies) למשך 30 דקות לפני ההדמיה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את התאים וphotoactivate כמו בשלב 3.1-3.8. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמונת התא ל45-דקות נוספות (ללא תמונה-הפעלה) כדי לקבוע היכן βAPP-paGFP מצטברת בהעדר המחשוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את המסירה של חלבון לlysosomes (או תא במורד הזרם אחר) ולאחר מכן אישור על פי השיטה המתוארת בשלב 6. </li></ol> 5. להבטיח דיוק של תמונות-הפעלה בתוך Golgi <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> HBSS חם-עד 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 2 מיליליטר, לכל צלחת confocal להיות צילמה, של 66 מיקרומטר nocodazole (טיפול) או DMSO (שליטה) בHBSS. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלחת confocal אחד, פיפטה 2 מיליליטר של 37 ° C HBSS ולהוסיף 7.96 μl של nocodazole ממניות nocodazole 16.60 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כביקורת כל כךlution, פיפטה 2 מיליליטר של 37 ° C HBSS לתוך צינור 2 מ&quot;ל ולהוסיף 7.96 μl של DMSO. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאים בHBSS עם nocodazole או DMSO ל5 דקות לפני ההדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את התאים כמו בשלב 3.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני photoactivation, להכין מיקרוסקופ כדי לקחת Z-ערימה לאחר תקופת צילום ההפעלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &quot;Z סטאק&quot;. להתחיל לסרוק באמצעות XY המהיר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את מישור המוקד עם כפתור כוונון מיקרוסקופ לחלק העליון של התא. לחץ על &quot;מארק הראשון&quot; כדי להגדיר את המיקום הראשון בערימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את מישור המוקד עם כפתור כוונון מיקרוסקופ לתחתית (הקרוב ביותר לזכוכית) של התא. לחץ על &quot;מארק האחרון &#39;כדי להגדיר את תפקידו האחרון במחסנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בפנל ערימת Z, לחץ על הכפתור &#39;Z חתך &quot;. הגדר את &#39;המרווח&#39; 1 מיקרומטר. הערה: רזולוציה מרחבית גבוהה מחסנית מרווח ערימה קטנה יותר, אבל יותר תמונות יצטרכולהילקח הארכת תקופת ההדמיה לערימה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להלבין את התאים, כמתואר בשלב 3.7-3.8. תמונה-הפעל ותמונה מ0 דקות עד 15 דקות (30 מסגרות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תפסיק הדמיה לאחר 30 מסגרות. מייד לשמור תמונה של הווידאו. זהירות: מיקרוסקופים מסוימים עשויים להחליף וידאו ראשון אם זה לא נשמר לפני שמתחיל רצף הדמיה שני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שמירת הווידאו, לרכוש מייד Z-ערימה, באמצעות הפרמטרים מהשלב 5.5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיתוף למקם βAPP-paGFP עם גאלט-CFP (או סמן Golgi אחר), כמתואר בשלב 6. הערה: CFP photobleaches במהירות ולא יכול להיות גלוי עד סוף תקופת ההדמיה. Colocalization לא יכול להיות אפשרי עם גאלט-CFP. אם נדרש colocalization, להשתמש mRFP לתייג גאלט. </li></ol> 6. שלפוחיות סינון וcolocalization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתכנית ניתוח (למשל Imaris) כדי להפוך את המשטחים של התא (למשל LAMP1-mRFP) וo חלבוןעניין F (למשל βAPP-paGFP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את הסעיף &#39;לעלות&#39; של תכנית הניתוח על ידי לחיצה על הכפתור לעלות על שורת תפריטים העליונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בלחצן אשף השטח בחלק העליון של רוב הפנל מהשמאל (5 כפתור ה מהשמאל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר ערוץ לסנן שלפוחית ​​(הקרינה כלומר βAPP-paGFP, חלבון של עניין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע חיסור רקע על ידי הגשת הקוטר של השלפוחית ​​הגדולה ביותר בתחום לאשף ולחץ על הבא. תכנית הניתוח בוחרת באופן אוטומטי - על בסיס סף נובע מהשלפוחית ​​הגדולה ביותר בתחום - האזור בערוץ של עניין. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ידני להתאים את רקע הסף כדי לחדד את הבחירה במידת הצורך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחלק התחתון של מסך בחירת הסף, לבדוק אפשרות של האובייקטים נוגעים ללב ספליט &quot;להפריד את המשטחים בשילוב. הערה: אם שלפוחית ​​רבות מקובצים באופן הדוק לgether, קבוצת תכנית ניתוח אובייקטים אלה תחת משטח אחד. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר 10-15 שלפוחית ​​נציג ולחשב את קוטר השלפוחית ​​הממוצע ולהזין את התוצאה באשף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחדד את נקודות זרע שנבחרו על ידי הגדלת או הקטנת הסף על &#39;איכות&#39; (עוצמת הערוץ באמצע כל מקום). הערה: משטחים של ערוץ עניין ייווצרו. חידוד נוסף של המשטחים שנבחרו ניתן לבצע בשלב זה. שלפוחית ​​סף המבוסס על מספר הפיקסלים בכל שלפוחית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסכת הערוץ המקורי עם משטח זה. כדי להסוות, בחר בכרטיסייה 4 מהשמאל באשף יצירת משטח (עיפרון). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחירה &#39;מסכה כל &quot;. ערוץ חדש עם שלפוחית ​​של עניין ייווצר. הערה: במהלך תהליך המסכה, אפשרות לשכפל את הערוץ המקורי מוצעת. בחר באפשרות זו אם נתונים המקוריים צריכה להיות נשמרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על ים6.1 teps דרך 6.7 לערוץ לא מסונן (כלומר LAMP1 mRFP, תא). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסרגל הכלים העליון, בחר בכלי colocalization. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בפנל העליון, כהיסטוגרמות של הערוצים להיות colocalized מופיעה, בחר את הערוצים רעולי פנים שנוצרו לאחרונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את כל הנתונים זמינים. יש פיקסלים כהים שלעתים נוכחי לאחר ניתוח. אל תבחרו פיקסלים אלה בהיסטוגרמה, הם להטות את התוצאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בפנל הימני הרחוק, בחר &#39;לבנות Coloc ערוץ &quot;. זה יוצר ערוץ חדש המכיל רק את הפיקסלים colocalized. הנתונים יהיו באותו הפנל תחת הכפתור &quot;ערוץ סטטיסטיקת&quot;. ניתן לייצא את הנתונים כקובץ CSV. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בנתון &quot;אחוז מהחומר colocalized &#39;. אפשרות זו לוקחת בחשבון את עוצמת פיקסלים והגודל של האובייקט. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Masters, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+plaque+core+protein+in+Alzheimer+disease+and+Down+syndrome.">Amyloid plaque core protein in Alzheimer disease and Down syndrome.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 82 (12), 4245-4249 (1985).</li><li>Vassar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Beta-secretase+cleavage+of+Alzheimer's+amyloid+precursor+protein+by+the+transmembrane+aspartic+protease+BACE.">Beta-secretase cleavage of Alzheimer's amyloid precursor protein by the transmembrane aspartic protease BACE.</a> Science. 286 (5440), 735-741 (1999).</li><li>De Strooper, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiency+of+presenilin-1+inhibits+the+normal+cleavage+of+amyloid+precursor+protein.">Deficiency of presenilin-1 inhibits the normal cleavage of amyloid precursor protein.</a> Nature. 391 (6665), 387-390 (1998).</li><li>Xia, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+complexes+with+the+C-terminal+fragments+of+amyloid+precursor+protein+at+the+sites+of+amyloid+beta-protein+generation.">Presenilin complexes with the C-terminal fragments of amyloid precursor protein at the sites of amyloid beta-protein generation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (16), 9299-9304 (2000).</li><li>Li, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin+1+is+linked+with+gamma-secretase+activity+in+the+detergent+solubilized+state.">Presenilin 1 is linked with gamma-secretase activity in the detergent solubilized state.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97 (11), 6138-6143 (2000).</li><li>Kim, W., Hecht, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+determinants+of+enhanced+amyloidogenicity+of+Alzheimer+A{beta}42+peptide+relative+to+A{beta}40.">Sequence determinants of enhanced amyloidogenicity of Alzheimer A{beta}42 peptide relative to A{beta}40.</a> J. Biol. Chem. 280 (41), 35069-35076 (2005).</li><li>Pawar, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+'aggregation-prone'+and+"aggregation-susceptible.">Prediction of 'aggregation-prone' and "aggregation-susceptible.</a> J. Mol. Biol. 350 (2), 379-392 (2005).</li><li>Wen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VPS35+haploinsufficiency+increases+Alzheimer's+disease+neuropathology.">VPS35 haploinsufficiency increases Alzheimer's disease neuropathology.</a> J. Cell Biol. 195 (5), 765-779 (2011).</li><li>Rogaeva, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuronal+sortilin-related+receptor+SORL1+is+genetically+associated+with+Alzheimer+disease.">The neuronal sortilin-related receptor SORL1 is genetically associated with Alzheimer disease.</a> Nat. Genet. 39 (2), 168-177 (2007).</li><li>Andersen, O. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+sorting+protein-related+receptor+sorLA/LR11+regulates+processing+of+the+amyloid+precursor+protein.">Neuronal sorting protein-related receptor sorLA/LR11 regulates processing of the amyloid precursor protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102 (38), 13461-13466 (2005).</li><li>Schmidt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SorLA/LR11+regulates+processing+of+amyloid+precursor+protein+via+interaction+with+adaptors+GGA+and+PACS-1.">SorLA/LR11 regulates processing of amyloid precursor protein via interaction with adaptors GGA and PACS-1.</a> J. Biol. Chem. 282 (45), 32956-32964 (2007).</li><li>Moreth, J., Mavoungou, C., Schindowski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+anti-amyloid+immunotherapy+in+Alzheimer's+disease:+What+are+the+most+promising+targets.">Passive anti-amyloid immunotherapy in Alzheimer's disease: What are the most promising targets.</a> Immun Ageing. 10 (1), 18 (2013).</li><li>Pasternak, S. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Presenilin-1,+nicastrin,+amyloid+precursor+protein,+and+gamma-secretase+activity+are+co-localized+in+the+lysosomal+membrane.">Presenilin-1, nicastrin, amyloid precursor protein, and gamma-secretase activity are co-localized in the lysosomal membrane.</a> J. Biol. Chem. 278 (29), 26687-26694 (2003).</li><li>Schrader-Fischer, G., Paganetti, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+alkalizing+agents+on+the+processing+of+the+beta-amyloid+precursor+protein.">Effect of alkalizing agents on the processing of the beta-amyloid precursor protein.</a> Brain Res. 716 (1-2), 91-100 (1996).</li><li>Golde, T., Estus, S., Younkin, L., Selkoe, D., Younkin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Processing+of+the+amyloid+protein+precursor+to+potentially+amyloidogenic+derivatives.">Processing of the amyloid protein precursor to potentially amyloidogenic derivatives.</a> Science. 255 (5045), 728-730 (1992).</li><li>Higaki, J., Quon, D., Zhong, Z., Cordell, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+beta-amyloid+formation+identifies+proteolytic+precursors+and+subcellular+site+of+catabolism.">Inhibition of beta-amyloid formation identifies proteolytic precursors and subcellular site of catabolism.</a> Neuron. 14 (3), 651-659 (1995).</li><li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Carboxyl-terminal+Fragments+of+Alzheimer+beta+-Amyloid+Precursor+Protein+Accumulate+in+Restricted+and+Unpredicted+Intracellular+Compartments+in+Presenilin+1-deficient+Cells.">Carboxyl-terminal Fragments of Alzheimer beta -Amyloid Precursor Protein Accumulate in Restricted and Unpredicted Intracellular Compartments in Presenilin 1-deficient Cells.</a> J. Biol. Chem. 275 (47), 36794-36802 (2000).</li><li>Perez, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutagenesis+identifies+new+signals+for+beta-amyloid+precursor+protein+endocytosis,+turnover,+and+the+generation+of+secreted+fragments,+including+Abeta42.">Mutagenesis identifies new signals for beta-amyloid precursor protein endocytosis, turnover, and the generation of secreted fragments, including Abeta42.</a> J. Biol. Chem. 274 (27), 18851-18856 (1999).</li><li>Cirrito, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endocytosis+Is+Required+for+Synaptic+Activity-Dependent+Release+of+Amyloid-&#946;+In+Vivo.">Endocytosis Is Required for Synaptic Activity-Dependent Release of Amyloid-&#946; In Vivo.</a> Neuron. 58 (1), 42-51 (2008).</li><li>Carey, R. M., Balcz, B. A., Lopez-Coviella, I., Slack, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+dynamin-dependent+endocytosis+increases+shedding+of+the+amyloid+precursor+protein+ectodomain+and+reduces+generation+of+amyloid+beta+protein.">Inhibition of dynamin-dependent endocytosis increases shedding of the amyloid precursor protein ectodomain and reduces generation of amyloid beta protein.</a> BMC Cell Biol. 6, 30 (2005).</li><li>Traub, L. M., Kornfeld, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trans-Golgi+network:+a+late+secretory+sorting+station.">The trans-Golgi network: a late secretory sorting station.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 9 (4), 527-533 (1997).</li><li>Vieira, S. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieval+of+the+Alzheimer's+amyloid+precursor+protein+from+the+endosome+to+the+TGN+is+S655+phosphorylation+state-dependent+and+retromer-mediated.">Retrieval of the Alzheimer's amyloid precursor protein from the endosome to the TGN is S655 phosphorylation state-dependent and retromer-mediated.</a> Mol Neurodegener. 5 (1), 40 (2010).</li><li>Sullivan, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer+disruption+promotes+amyloidogenic+APP+processing.">Retromer disruption promotes amyloidogenic APP processing.</a> Neurobiol. Dis. 43 (2), 338-3345 (2011).</li><li>Fjorback, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retromer+binds+the+FANSHY+sorting+motif+in+SorLA+to+regulate+amyloid+precursor+protein+sorting+and+processing.">Retromer binds the FANSHY sorting motif in SorLA to regulate amyloid precursor protein sorting and processing.</a> J. Neurosci. 32 (4), 1467-1480 (2012).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Photoactivatable+GFP+for+Selective+Photolabeling+of+Proteins+and+Cells.">A Photoactivatable GFP for Selective Photolabeling of Proteins and Cells.</a> Science. 297 (5588), 1873-1877 (2002).</li><li>Patterson, G. H., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+photolabeling+of+proteins+using+photoactivatable+GFP.">Selective photolabeling of proteins using photoactivatable GFP.</a> Methods. 32 (4), 445-450 (2004).</li><li>Hirschberg, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+secretory+protein+traffic+and+characterization+of+golgi+to+plasma+membrane+transport+intermediates+in+living+cells.">Kinetic analysis of secretory protein traffic and characterization of golgi to plasma membrane transport intermediates in living cells.</a> J. Cell Biol. 143 (6), 1485-1503 (1998).</li><li>Kim, P. K., Mullen, R. T., Schumann, U., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+origin+and+maintenance+of+mammalian+peroxisomes+involves+a+de+novo+PEX16-dependent+pathway+from+the+ER.">The origin and maintenance of mammalian peroxisomes involves a de novo PEX16-dependent pathway from the ER.</a> J. Cell Biol. 173 (4), 521-532 (2006).</li><li>Hailey, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitochondria+supply+membranes+for+autophagosome+biogenesis+during+starvation.">Mitochondria supply membranes for autophagosome biogenesis during starvation.</a> Cell. 141 (4), 656-667 (2010).</li><li>Tam, J. H. K., Seah, C., Pasternak, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Amyloid+Precursor+Protein+is+rapidly+transported+from+the+Golgi+apparatus+to+the+lysosome+and+where+it+is+processed+into+beta-amyloid.">The Amyloid Precursor Protein is rapidly transported from the Golgi apparatus to the lysosome and where it is processed into beta-amyloid.</a> Mol. Brain. 7 (1), 54 (2014).</li><li>Scott, D. A., Das, U., Tang, Y., Roy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+logic+underlying+the+axonal+transport+of+cytosolic+proteins.">Mechanistic logic underlying the axonal transport of cytosolic proteins.</a> Neuron. 70 (3), 441-454 (2011).</li><li>Herl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+amyloid+precursor+protein+affect+its+interactions+with+presenilin/gamma-secretase.">Mutations in amyloid precursor protein affect its interactions with presenilin/gamma-secretase.</a> Mol. Cell. Neurosci. 41 (2), 166-174 (2009).</li><li>Lorenzen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+Direct+Transport+of+Cell+Surface+APP+to+the+Lysosome+defines+a+novel+selective+pathway.">Rapid and Direct Transport of Cell Surface APP to the Lysosome defines a novel selective pathway.</a> Mol. Brain. 3 (1), 11 (2010).</li><li>Thinakaran, G., Teplow, D. B., Siman, R., Greenberg, B., Sisodia, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolism+of+the+'Swedish'+amyloid+precursor+protein+variant+in+neuro2a+(N2a)+cells.+Evidence+that+cleavage+at+the+beta-secretase";site+occurs+in+the+golgi+apparatus.">Metabolism of the 'Swedish' amyloid precursor protein variant in neuro2a (N2a) cells. Evidence that cleavage at the beta-secretase";site occurs in the golgi apparatus.</a> J. Biol. Chem. 271 (16), 9390-9397 (1996).</li><li>Thinakaran, G., Koo, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amyloid+Precursor+Protein+Trafficking,+Processing,+and+Function.">Amyloid Precursor Protein Trafficking, Processing, and Function.</a> J. Biol. Chem. 283 (44), 29615-29619 (2008).</li><li>Schneider, M., Barozzi, S., Testa, I., Faretta, M., Diaspro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-Photon+Activation+and+Excitation+Properties+of+PA-GFP+in+the+720-920-nm+Region.">Two-Photon Activation and Excitation Properties of PA-GFP in the 720-920-nm Region.</a> Biophys. J. 89 (2), 1346-1352 (2005).</li><li>Sevier, C. S., Weisz, O. A., Davis, M., Machamer, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+export+of+the+vesicular+stomatitis+virus+G+protein+from+the+endoplasmic+reticulum+requires+a+signal+in+the+cytoplasmic+tail+that+includes+both+tyrosine-based+and+di-acidic.">Efficient export of the vesicular stomatitis virus G protein from the endoplasmic reticulum requires a signal in the cytoplasmic tail that includes both tyrosine-based and di-acidic.</a> 11 (1), 13-22 (2000).</li><li>Muresan, V., Varvel, N. H., Lamb, B. T., Muresan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cleavage+products+of+amyloid-beta+precursor+protein+are+sorted+to+distinct+carrier+vesicles+that+are+independently+transported+within+neurites.">The cleavage products of amyloid-beta precursor protein are sorted to distinct carrier vesicles that are independently transported within neurites.</a> J. Neurosci. 29, 3565-3578 (2009).</li></ol>

יש הסופרים לא אינטרסים כלכליים מתחרים או ניגוד עניינים.

טכניקה זו מתארת ​​את התמונה-ההפעלה מדויקת של חלבוני קרום מתויגים עם paGFP בTGN לדמיין סחר ומחשוף שלאחר מכן. בעוד paGFP נוצר לפני למעלה מעשור 25, זה הוא הדוגמא הראשונה של תמונה-הפעלה מדויקת למעקב הסחר של חלבונים המתהווה לתאים במורד הזרם. מחקרים קודמים באמצעות APP-paGFP בונ?...

סימן ההיכר של מחלת אלצהיימר (AD) הוא הנוכחות של פלאק סנילי וסבכים נוירו-פיברילריים (NFTS) במוח. המרכיב המרכזי של לוחות סנילי הוא β עמילואיד (Aβ). Aβ נגזר ממבשרה; חלבון המוצא לעמילואיד (APP) 1. מחשוף amyloidogenic של APP מתחיל בהסרת ectodomain מAPP על ידי β-secretase 2. בר מסוף carboxyl 99-השאריות שנותר (CTF) ניתן ביקע ידי γ-secretase לייצר Aβ 3-7. בעוד ניסויים רבים תעדו את המחשוף של שטח פני תא APP לאחר הפנמה מתא השטח למערכת endosomal / lysosomal, מספר המחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי סחר תאיים של APP הוא גם חשוב בויסות העיבוד שלה 8-11. היו כמה ניסיונות בויסות הרמות של Aβ עם מעכבי γ-secretase וimmun Aβotherapies. עם זאת, ניסויים קליניים האחרונים בטיפולים אלה לא הראו שום תועלת, ו, במקרים מסוימים, גרם נזק 12. אסטרטגיה בלתי מנוצלת לווסת ייצור Aβ היא לשנות את לוקליזציה המשנה הסלולר של APP ואינטראקציה γ-secretase. Golgi, קרום פלזמה, וendosomes / lysosomes שכל הוצע כמקומות אפשריים לγ-מחשוף של APP. מחקר מהמעבדה שלנו מצביע על כך שAPP וγ-secretase הם חלבוני תושב קרום lysosomal 13. יתר על כן, מצאנו כי יש lysosomal γ-secretase pH האופטימלי חומצי 13. בנוסף, alkalization של מערכת endosomal / lysosomal עם chloroquine או NH 4 Cl, הוכח להפחית את הייצור של 14 Aβ. γ-secretase עיכוב או בנוקאאוט או presenilin מוביל להצטברות APP-CTFs ב15-17 הליזוזום. יתר על כן, שיבוש אנדוציטוזה APP מוריד ייצור Aβ 18-20. למרות חשיבותו של Golgi כתחנת מיון לחלבונים וחלבונים ממוחזרים ממערכת endosomal / lysosomal המתהווים, הסחר תאיים של APP לא נחקר בפירוט 21. מחקר שנערך לאחרונה הראה כי APP יכול להיות ממוחזר לרשת טרנס Golgi (TGN) באמצעות אינטראקציה עם מורכב retromer. רגולציה כלפי מטה של מתחם retromer מפחיתה את ייצור Aβ 8,22-24. עם זאת, היציאה של APP מGolgi לא נחקרה היטב. בעוד הבא אנדוציטוזה של חלבונים על פני קרום התא, כגון קולט transferrin, מתויגים בקלות ואחריו, בעקבות הסחר של חלבונים תאיים הוא מאתגר יותר. למעשה, כמה חלבונים יש לי הסחר תאיים שלהם צילם. כניסתו של תגי חלבון פלואורסצנטי, כגון צילום activatable-GFP (paGFP), סיפקה כלים חדשים לבחינת סחר תאית. תמונה-activatable-GFP הוא צורה של GFP שהוא כמעט בלתי נראה לאחר סינתזה, אבל מפתחת ירוקה הקרינה חזקה (GFP) לאחר שהופעל על ידי 413 אור לייזר ננומטר והאיתותים יציבה לימים 25,26. מבנים באמצעות paGFP שימשו כדי להדגים את סחר intralysosomal של חלבון lysosomal חלבון קרום 1 (LAMP1) 25, מסירת השטח פני תא של וירוס שלפוחי Stomatitis גליקופרוטאין (VSVG, סמן של מסלול ההפרשה) 27, והמחזור של peroxisomes 28 וautophagosomes 29. על מנת להמחיש את המיון של APP מTGN בתאים חיים, עיצבנו פלסמיד המבטא את 112 חומצות אמינו האחרונות של APP מצמידים את התמונה-activatable (paGFP) על C-המסוף (מכונה βAPP-paGFP) 30. יש לנו גם ביצעתי ניסויים אלה עם APP באורך מלא והשיגו תוצאות דומות; מבנה ΒAPP משמש כאן משום שהוא מספק תמונות בהירות. לאחר מכן, אנו צילום הפעל ו# 946; APP-paGFP רק בTGN, כמוגדר על ידי TGN סמן Galactosyltransferase (גאלט). למרות APP כבר תויג עם paGFP לדמיין תחבורה מהירה axonal של APP ואישור מאזור perinuclear, זה ההפגנה הראשונה של סחר APP מאחד תא מוגדר בזהירות ל11,31,32 אחר. הנה, אנחנו מדגימים תמונה-הפעלה מדויקת בתוך TGN ויציאה של APP לתאים במורד הזרם ומחשוף שלאחר מכן ואישור מlysosomes 30. צילום ההפעלה מדויקת בתוך Golgi היא נרחב החלים על מערכות חלבון אחרות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>35-mm glass bottom culture dishes&#160;</td>
			<td>Matek</td>
			<td>P-35G-1.5-20-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>14025-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lipofectamine 2000</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11995-092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilin/Streptomycin</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dibutyrl cyclic AMP</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>D0627</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat in activated Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heated Microscopy stage insert P</td>
			<td>PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tempcontrol 37&#8211;2 digital 2-channel</td>
			<td>PeCon GmbH</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss LSM-510 META laser- scanning microscope&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>with laser diode, argon laser, and HeNe1 laser</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss 63&#215; 1.4 numerical aperture oil immersion lens&#160;</td>
			<td>Carl Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L685, 458&#160;</td>
			<td>EMD Millipore</td>
			<td>565771</td>
			<td>dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>cholorquine&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C6628&#160;</td>
			<td>dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nocodazole</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>M1404</td>
			<td>dissolved in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulphoxide&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>472301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris&#160;</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>with colocalization package&#160;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging the intracellular trafficking of app with photoactivatable gfp

ביתא-עמילואיד (Aβ) הוא המרכיב המרכזי של סנילי לוחות שנמצאו במוחם של החולים במחלת האלצהיימר. Aβ נגזר מהמחשוף רציף של חלבון עמילואיד מבשר (APP) על ידי β וγ-secretases. למרות חשיבותו של Aβ לפתולוגיה לספירה, לוקליזציה subcellular של שסעים אלה אינה מבוססת היטב. עבודה במעבדה שלנו ואחרים לסבך את מערכת endosomal / lysosomal בעיבוד APP לאחר הפנמה מתא השטח. עם זאת, הסחר תאיים של APP הוא יחסית understudied. בעוד חלבונים על פני קרום התא הם amendable לטכניקות תיוג רבים, אין שיטות פשוטות לבעקבות הסחר של חלבונים בממברנה מGolgi. לשם כך, יצרנו מבני APP שתויגו עם GFP צילום activatable (paGFP) בC-הסופית. לאחר סינתזה, יש paGFP הקרינה בסיס נמוכה, אבל זה יכול להיות מגורה עם לא אור 413 ננומטרo לייצר הקרינה חזקה, יציבה ירוקה. על ידי שימוש בGolgi סמן Galactosyl transferase מצמידים את חלבון ציאן פלורסנט (גאלט-CFP) כמטרה, אנחנו מסוגלים APP מדויק photoactivate ברשת טרנס Golgi. אז יכול להיות אחרי מופעל-תמונות APP-paGFP כפי שtraffics לתאים במורד הזרם מזוהה עם fluorescently מתויג חלבוני סמן תא לאנדוזום מוקדם (Rab5), אנדוזום מאוחר (Rab9) והליזוזום (LAMP1). יתר על כן, שימוש במעכבים לעיבוד APP כולל chloroquine או L685 מעכב γ-secretase, 458, אנו מסוגלים לבצע ניסויי דופק מרדף לבחון את העיבוד של APP בתאים בודדים. אנו מוצאים כי חלק גדול של APP נע במהירות להליזוזום מבלי להיראות על פני השטח של התאים, ולאחר מכן פינה מהליזוזום ידי שסעים כמו secretase. טכניקה זו ממחישה את התועלת של paGFP לבעקבות הסחר והעיבוד של חלבונים תאיים הלוך ושובמ &#39;Golgi לתאים במורד הזרם.

תוצאות אופייניות להראות βAPP עוזב TGN ומופיע לתנועה במהירות לLAMP1 (איור 1 א &#39;וב&#39;). במהלך תקופת צילום ההפעלה, ניתן לראות שלפוחית ​​היוצאת Golgi מיועד לlysosomes (איור 1). ללא טיפול מעכב, הקרינה paGFP תהיה גלויה בlysosomes בעוד שתמונה-הפעלה בTGN. לאחר הפסקת photoactivation, βAPP-...

Watch this Scientific Journal Video about Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP at JoVE.com

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

בעוד התחבורה של חלבונים בתא שטח נלמדת בקלות יחסית, לדמיין את הסחר של חלבונים תאיים הוא הרבה יותר קשה. כאן, אנו משתמשים בשילוב מבני GFP photoactivatable ולהפגין שיטה לעקוב במדויק את החלבון המוצא לעמילואיד מהמערכה גולג&#39;י לתאים למטה זרם ועיקבו אחרי שחרורה.

הדמיה הסחר תאיים של APP עם GFP Photoactivatable

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

imaging-the-intracellular-trafficking-of-app-with-photoactivatable-gfp

Research

JoVE Journal

Biology

11.7K Views.  Western University.  בעוד התחבורה של חלבונים בתא שטח נלמדת בקלות יחסית, לדמיין את הסחר של חלבונים תאיים הוא הרבה יותר קשה. כאן, אנו משתמשים בשילוב מבני GFP photoactivatable ולהפגין שיטה לעקוב במדויק את החלבון המוצא לעמילואיד מהמערכה גולג'י לתאים למטה זרם ועיקבו אחרי ש?...

Video: Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Labeling hESCs and hMSCs with Iron Oxide Nanoparticles for Non-Invasive in vivo Tracking with MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative medicine. A non-invasive method to monitor the transplanted stem cells repeatedly in vivo would greatly enhance our ability to understand the mechanisms that control stem cell death and identify trophic factors and signaling pathways that improve stem cell engraftment. MR imaging has been proven to be an effective tool for the in vivo depiction of stem cells with near microscopic anatomical resolution. In order to detect stem cells with MR, the cells have to be labeled with cell specific MR contrast agents. For this purpose, iron oxide nanoparticles, such as superparamagnetic iron oxide particles (SPIO), are applied, because of their high sensitivity for cell detection and their excellent biocompatibility. SPIO particles are composed of an iron oxide core and a dextran, carboxydextran or starch coat, and function by creating local field inhomogeneities, that cause a decreased signal on T2-weighted MR images. This presentation will demonstrate techniques for labeling of stem cells with clinically applicable MR contrast agents for subsequent non-invasive in vivo tracking of the labeled cells with MR imaging.

For the evaluation of new stem cell therapies it is important to non-invasively track the injected cells in vivo. This video will show you how to label human mesenchymal and embryonic stem cells with iron oxide based contrast agents in vivo for subsequent MR imaging in vivo.

תיוג hESCs ו hMSCs עם ברזל אוקסיד חלקיקים עבור פולשני של מעקב vivo עם MR Imaging

In recent years, stem cell research has led to a better understanding of developmental biology, various diseases and its potential impact on regenerative ...

Labeling Stem Cells with Fluorescent Dyes for non-invasive Detection with Optical Imaging

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo labeling of stem cells with a fluorescent dye, subsequent intravenous injection of the labeled cells and visualization of their accumulation in specific target organs or pathologies. The presented technique demonstrates how we label human mesenchymal stem cells (hMSC) by simple incubation with the lipophilic fluorescent dye DiD (C67H103CIN2O3S) and how we label human embryonic stem cells (hESC) with the FDA approved fluorescent dye Indocyanine Green (ICG). The uptake mechanism is via adherence and diffusion of the lypophilic dye across the phospholipid cell membrane bilayer. The labeling efficiency is usually improved if the cells are incubated with the dye in serum-free media as opposed to incubation in serum-containing media. Furthermore, the addition of the transfection agent Protamine Sulfate significantly improves contrast agent uptake.

This video shows techniques for labeling of human embryonic stem cells and mesenchymal stem cells with fluorescent dyes. This technique can be used for an in vivo tracking of transplanted stem cells with optical imaging and for histopathological correlations with fluorescence microscopy.

תיוג בתאי גזע עם צבעי ניאון על איתור פולשני עם דימות אופטי

Optical imaging (OI) is an easy, fast and inexpensive tool for in vivo monitoring of new stem cell based therapies. The technique is based on ex vivo ...

Transplantation of GFP-expressing Blastomeres for Live Imaging of Retinal and Brain Development in Chimeric Zebrafish Embryos

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their environment. Chimeric embryos, which are composed of cells of different genetic background, are great tools to study the cell-cell interactions mediated by genes of interest. The embryonic transparency of zebrafish at early developmental stages permits direct visualization of the morphogenesis of tissues and organs at the cellular level. Here, we demonstrate a protocol to generate chimeric retinas and brains in zebrafish embryos and to perform live imaging of the donor cells. The protocol covers the preparation of transplantation needles, the transplantation of GFP-expressing donor blastomeres to GFP-negative hosts, and the examination of donor cell behavior under live confocal microscopy. With slight modifications, this protocol can also be used to study the embryonic development of other tissues and organs in zebrafish. The advantages of using GFP to label donor cells are also discussed. 

We demonstrate a protocol to generate chimeric zebrafish embryos for live imaging cellular behavior during embryogenesis.

השתלה של ה-GFP-לבטא בלסטומרים עבור הדמיה חיה של התפתחות המוח ואת רשתית עוברי דג הזברה chimeric

Cells change extensively in their locations and property during embryogenesis. These changes are regulated by the interactions between the cells and their ...

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) Using Retroviral Vector with GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has been previously shown that human somatic cells can be reprogrammed to pluripotency by ectopic expression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and Myc) and become induced pluripotent stem cells (iPSCs)2-4 . Like hESCs, human iPSCs are pluripotent and a potential source for autologous cells. Here we describe the protocol to reprogram human fibroblast cells with the four reprogramming factors cloned into GFP-containing retroviral backbone4. Using the following protocol, we generate human iPSCs in 3-4 weeks under human ESC culture condition. Human iPSC colonies closely resemble hESCs in morphology and display the loss of GFP fluorescence as a result of retroviral transgene silencing. iPSC colonies isolated mechanically under a fluorescence microscope behave in a similar fashion as hESCs. In these cells, we detect the expression of multiple pluripotency genes and surface markers.

Reprogramming Human Somatic Cells into Induced Pluripotent Stem Cells iPSCs Using Retroviral Vector with GFP

A method to generate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) via retrovirus-mediated ectopic expression of OCT4, SOX2, KLF4 and MYC is described. A practical way to identify human iPSC colonies based on GFP expression is also discussed.

תכנות מחדש האדם תאים סומטיים תוך המושרה בתאי גזע pluripotent (iPSCs) באמצעות וקטור retroviral עם GFP

Human embryonic stem cells (hESCs) are pluripotent and an invaluable cellular sources for in vitro disease modeling and regenerative medicine1. It has ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

הדמיה תפקודית של שומן חום בעכברים עם FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ביציות

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Drosophila eye is widely used as a model for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic recombination technique, elegant genetic screens based on clonal analysis have led to the identification of signaling pathways involved in eye development and photoreceptor (PR) differentiation at larval stages. We describe here the Tomato/GFP-FLP/FRT method, which can be used for rapid clonal analysis in the eye of living adult Drosophila. Fluorescent photoreceptor cells are imaged with the cornea neutralization technique, on retinas with mosaic clones generated by flipase-mediated recombination. This method has several major advantages over classical histological sectioning of the retina: it can be used for high-throughput screening and has proved an effective method for identifying the factors regulating PR survival and function. It can be used for kinetic analyses of PR degeneration in the same living animal over several weeks, to demonstrate the requirement for specific genes for PR survival or function in the adult fly. This method is also useful for addressing cell autonomy issues in developmental mutants, such as those in which the establishment of planar cell polarity is affected.

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

The Tomato/GFP-FLP/FRT method involves visualizing mosaic photoreceptor cells in living Drosophila. It can be used to follow individual photoreceptor cell fates in the retina for days or weeks. This method is ideal for studies of retinal degeneration and neurodegenerative diseases or photoreceptor cell development.

העגבניות / GFP-FLP / FRT שיטת ההדמיה חיה של פסיפס למבוגרים בלבד<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאי קולטי אור

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

Rapid Synthesis and Screening of Chemically Activated Transcription Factors with GFP-based Reporters

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the structure of native control circuits. In both cases, the ability to program gene expression in a rapid and tunable fashion, with no off-target effects, can be useful. We have constructed yeast strains containing the ACT1 promoter upstream of a URA3 cassette followed by the ligand-binding domain of the human estrogen receptor and VP16. By transforming this strain with a linear PCR product containing a DNA binding domain and selecting against the presence of URA3, a constitutively expressed artificial transcription factor (ATF) can be generated by homologous recombination. ATFs engineered in this fashion can activate a unique target gene in the presence of inducer, thereby eliminating both the off-target activation and nonphysiological growth conditions found with commonly used conditional gene expression systems. A simple method for the rapid construction of GFP reporter plasmids that respond specifically to a native or artificial transcription factor of interest is also provided.

This protocol describes an experimental procedure for the rapid construction of artificial transcription factors (ATFs) with cognate GFP reporters&#160;and quantification of the ATFs ability to stimulate GFP expression via flow cytometry.

סינתזה והקרנה של גורמי שעתוק הופעל כימי עם כתבים המבוסס על ה-GFP מהיר

Synthetic biology aims to rationally design and build synthetic circuits with desired quantitative properties, as well as provide tools to interrogate the ...

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

Elevated lipogenesis is a common characteristic of cancer and metabolic diseases. Sterol regulatory element-binding proteins (SREBPs), a family of membrane-bound transcription factors controlling the expression of genes important for the synthesis of cholesterol, fatty acids and phospholipids, are frequently upregulated in these diseases. In the process of SREBP nuclear translocation, SREBP-cleavage activating protein (SCAP) plays a central role in the trafficking of SREBP from the endoplasmic reticulum (ER) to the Golgi and in subsequent proteolysis activation. Recently, we uncovered that glucose-mediated N-glycosylation of SCAP is a prerequisite condition for the exit of SCAP/SREBP from the ER and movement to the Golgi. N-glycosylation stabilizes SCAP and directs SCAP/SREBP trafficking. Here, we describe a protocol for the isolation of membrane fractions in human cells and for the preparation of the samples for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further provide a method to monitor SCAP trafficking by using confocal microscopy. This protocol is appropriate for the investigation of SCAP N-glycosylation and trafficking in mammalian cells.

Analysis of SCAP N-glycosylation and Trafficking in Human Cells

We describe a modified method for membrane fraction isolation from human cells and sample preparation for the detection of SCAP N-glycosylation and total protein by using western blot. We further introduce a GFP-labeling method to monitor SCAP trafficking using confocal microscopy. This protocol can be used in regular biology laboratories.