שלום לכולם, שמי ד"ר ביפאשה בוס. אני עובד כפרופסור חבר ומ אחראי במרכז לתאי גזע ורפואה רגנרטיבית, מרכז המחקר Yenepoya, אוניברסיטת Yenepoya, מנגלור, הודו. עכשיו אנחנו הולכים להדגים כיצד לזהות את הנוכחות עבור ROS כלומר, מיני חמצן תגובתי"בתרבויות לחיות מן המשטחים העין העכבר שנחשפו מינונים שונים של קרינת אולטרה סגול-C.
היתרון של טכניקה זו הוא שכאן אנו יכולים לזהות בו זמנית לנוכחות של מיני חמצן תגובתי, תאים חיים ומתים, ללא צורך בתאי Vester. העיקרון של טכניקה זו טמון למעשה חבירה התא החי של DCFDA צבע. DCFDA הוא צבע חי מחלחל חסר צבע, אשר במהלך סטרס חמצוני מקבל פעל על ידי אוקסידזות תאיים מקבל מומר DCF פלואורסצנטי ירוק.
לפיכך, הצמחייה הירוקה מאפשרת לנו לזהות נוכחות של מיני חמצן תגובתי בתאים החיים. מצד שני, פרופידיום יודיד הוא צבע מחלחל תא מת אך ורק אשר פלואורסצנטי אדום. זה צבע משולב כפול תקוע rDNA.
עם זאת, הצבע Hoechst הוא מחלחל הן לתאים חיים ומתים. זה כתם גרעיני בצבע כחול. לפיכך, זוהי שיטה פשוטה מאוד שבה אנו יכולים לזהות נוכחות של מיני חמצן תגובתי בתרבויות ארוכות טווח באופן תלוי זמן יחד עם הערכה של תאים מתים.
נקודת צלחת שני מיליון תאים לכל 35 מילימטר מנות תרבות. התאים שאנו מיישמים הם התאים מפני השטח העין של העכבר. הסר נפח מרבי של מדיה מכל אחת ממנות תרבות התאים.
השאירו מאחור כ-500 מיקרוליטרים של מדיית תאים במגע הדוק עם התאים. כמות מינימלית של מדיה תמנע ייבוש של התאים. עם זאת, המטרה של כמות מינימלית של מדיה היא לאפשר חדירה מקסימלית של חשיפה UVC.
קח את התאים תחת מקור UV, זה יכול להיות גם Crosslinker UV, או יכול להיות כל מקור אולטרה סגול-C אחר. לחשוף את התאים למינון שונה של קרינת UVC כגון אחד, 10, 100, 1, 000, ו 10, 000 joules למ"ר. כאשר התאים נחשפו לקרינה אולטרה סגולה-C, המכסים צריכים להיות במצב פתוח.
זה יאפשר חדירה מקסימלית של אולטרה סגול-C לתאים ולכן להראות את המינון האופטימלי-תגובה של התאים לקרינה אולטרה סגולה-C. הביאו את התאים למכסה המנוע של זרימת האוויר למינאר וחדשו כל אחת מהמנות עם שני מיליליטר של מדיה שלמה. מדיה שלמה זו מכילה 20% סרום שור עוברי ב- DMEM, בתוספת תוספי מזון כגון 1% מינימום חומצות אמינו לא חיוניות, וגם 1%אנטיביוטיקה כי הוא פניצילין סטרפטומיצין.
לאחר מכן, לאחר חידוש המלאי בנפח מרבי, כלומר שני מיליליטר של מדיה מלאה, להחזיר את הצלחות לחממה ואת האינקובטה לתקופה של שלוש שעות על מנת לראות השפעות מוקדמות של קרינת אולטרה סגול-C. הכינו את מדיית הכתמת התא החי ב-15 הדקות האחרונות של דגירה של תאי UVC לאחר שלוש שעות. מדיה מכתימה מוכנה ב- 10%FBS המכיל DMEM מחומם מראש ל- 37 מעלות.
להכנת 10 מיליליטר של מדיה מכתים, תחילה להוסיף חמישה microliter של DCFDA ממניה של 10 מילימולר כדי להשיג ריכוז סופי של חמישה micromolar. מערבבים היטב על ידי צינור למעלה ולמטה. שנית, להוסיף חמישה microliter של פתרון Hoechst ממניה של 10 מיליגרם למיליליטר כדי לקבל ריכוז סופי של חמישה מיקרוגרם לכל mL.
עכשיו לערבב היטב על ידי צינור למעלה ולמטה. לבסוף להוסיף 200 microliters של פרופידיום יודיד ממניה של מיליגרם אחד לכל mL כדי לקבל ריכוז סופי של 20 מיקרוגרם לכל mL. מערבבים היטב על ידי צינור למעלה ולמטה.
עכשיו פתרון הכתמים מוכן לשימוש. לאחר שלוש שעות של אינקובציה לאחר חשיפה UVC, להסיר את הצלחות מאינקובטור CO2. שאף את התקשורת מכל אחת מהמנות שנחשפו למינון שונה של UVC כגון אחת, 10, 100, 1, 000 ו- 10, 000 joules למ"ר.
עכשיו מוסיפים שני מיליליטר של מדיה מוכתמת תאים חיים טריים לכל אחת מהמנות בעדינות מצדי הכלים. מחזירים את הצלחות שוב לאנקובטור CO2 וגוררים במשך 15 דקות להכתמת תאים חיים. לאחר 15 דקות של דגירה במדיה להכתמת תאים חיים, הסר את מדיית הכתמים מכל אחת מהמנות המכילות תאים החשופים למנות שונות של קרינת אולטרה סגול-C.
לחדש את התאים עם שני מיליליטר של מדיה מלאה. כעת התאים מוכנים להצגה. עכשיו למקם את תאי הבקרה תחת השדה הבהיר של התמונה הפלואורסצנטי.
התאים נראים נורמליים ככל הנראה מכיוון שהם תאי בקרה. תחת השדה הכחול אנחנו יכולים פלואורסצנטי תאים הכולל. תחת השדה הירוק מציג את הדור ROS.
מאחר ש מדובר בתאי בקרה, לא נוצר ROS. מתחת לשדה האדום, תאים מתים מוכתמים פרופידיום יודיד גלויים. לאחר מכן לשמור על UV חשוף 100 joules למטר מרובע מתחת לשדה בהיר.
מתחת לשדה הכחול, וגם אנו יכולים לראות את מספר התא הכולל מתחת לשדה הכחול. עם זאת, כאשר אנו חושפים לשדה ירוק, תאים חיוביים DCFDA נראים, וגם תאים מתים חיוביים PI נראים. לבסוף, מניחים את המינון המרבי UV, כלומר 10, 000 joules למטר תאים חשופים מרובע, תחת השדה הבהיר.
אנחנו יכולים לראות מורפולוגיה של תאים לא תקינים. עם זאת, תחת השדה הכחול אנו יכולים לראות תאים כחולים מוחלטים. תחת השדה הירוק, תאים חיוביים DCFDA פלואורסצנטי ירוק נראים המציין את הדור ROS.
כאשר התאים נחשפים לשדה אדום, כל התאים היו פלואורסצנטי אדום המציין מספר רב של מוות תאי כאשר התאים מטופלים עם 10, 000 joules למטר מרובע של מינון UV. עכשיו לסדר את התמונות שנתפסו בערוצים שונים לתוך לוח תמונה מורכבת אחת המתאימה מינונים אולטרה סגול-C ופקדים שלא נתלו. התמונות מסודרות בחלונית אחת בקבוצה.
ראשית, השדה הבהיר. שנית, הכתם הגרעיני הכחול של הויכסט. שלישית, כתמי פרופידיום יודיד באשר לגרעין מת.
רביעית, DCFDA לתאים חיוביים ROS. וחמישית, התמונה הממוזגת. כאשר אנו מסתכלים על השורה הראשונה והשניה של תמונות, כי הוא שליטה שלא נחשפה ואת התאים שנחשפו למינון UVC אחד joule למטר מרובע, הבחנו כי לא היו תאים חיוביים PI ולא ROS כי האיר, ובכך מצביע על היעדר מוחלט של ROS ומוות התא בפקדים שלא נחשפו כזה מינון UVC נמוך של ג'ול אחד למטר מרובע.
עכשיו מגיע לשורה השלישית של תמונות מורכבות של התאים שנחשפו 100 joules למטר מרובע. אחוז נמוך מאוד של תאים, כ -10% היו חיוביים הן עבור PI והן DCFDA במינון זה, ובכך מצביע על כמות נמוכה של ייצור ROS ומוות תאים. עכשיו אנחנו עוברים למינון גבוה יותר של חשיפה לקרינה UVC, כלומר 1, 000 joules למ"ר כפי שצוין בשורה הרביעית של התמונה המשולבת.
כאן, כ -70% מהתאים היו חיוביים עבור PI ו- DCFDA. לבסוף, אנו עוברים למינון הגבוה ביותר של חשיפה UVC, כלומר 10, 000 joules למ"ר כפי שמוצג בשורה החמישית של התמונה המשולבת. כאן נמצאו כי כמעט 100% מהתאים היו חיוביים הן עבור PI והן עבור DCFDA, ובכך הצביעו על מוות של 100% תאים ודור ROS במינון UVC מסוים זה.
העבר את התמונות לתוכנת ההדמיה. פתח תחילה את התמונה הכחולה המציינת את הגרעינים המוכתמים של הושט, זהו המספר הכולל של תאים. פתח את כלי הספירה ולחץ על כל אחד מהתאים בזה אחר זה כדי לקבל את המספר.
כעת פתח את התמונה שנלכדה מתחת לתעלה האדומה המציינת את התאים המתים החיוביים של PI. פתח את כלי הספירה ולחץ על כל אחת מהנקודות האדומות המציינות את הספירה עבור התאים המתים החיוביים של PI. לאחר ספירת התאים המתים נגמר, לחץ על הערוץ הירוק שנתפסו תאים ולפתוח את כלי הספירה ולחץ על כל אחד מהנקודות הירוקות המציין את התאים המציגים את הדור ROS.
השלם את ספירת התאים הירוקים שנלכדו תחת הערוץ הירוק ולאחר מכן באמצעות הנוסחה לספור את אחוז המוות של תאים על ידי נזק UVC ואחוז ייצור ROS על ידי נזק UVC. זה מחושב באמצעות מספר הנוסחה הפשוטה של תאים חיוביים PI, כלומר תאים פלואורסצנטיים אדומים, מחולק במספר התאים החיוביים Hoechst כפול 100. אחוז ייצור ROS על ידי נזק UV מחושב באמצעות הנוסחה, מספר DCFDA חיובי, או תאים פלואורסצנטיים ירוקים, מחולק במספר התאים החיוביים Hoechst כפול 100.
ברגע שיש לך את שני האחוזים, כלומר אחוז מוות של תאים ואת אחוז ייצור ROS, להשתמש בערכים אלה כדי להתוות גרף עמודות. ציר X מציין את המינון של UV, ואילו ציר y מציין את אחוז התאים. הסורגים הירוקים מציינים את אחוז יצירת ROS, בעוד שהסורג האדום מציין את אחוז המוות של תאים.
לאחר ניתוח, ברור כי במינון UVC 100 joules יש 10%ROS יצירת תאים, כמו גם 10% מוות תאי. בעוד במינון UVC 10 העלה לשלוש joules למטר מרובע, 70% תאים הציגו ייצור ROS, כמו גם מוות של תאים. בעוד במינון הגבוה ביותר של UVC, כלומר 10 הרים לארבעה joules למ"ר, כ 100% תאים הציגו מוות של תאים, כמו גם ייצור ROS.
לפיכך, ניתן להסיק כי יש מתאם חיובי חזק בין הדור ROS ומוות התא. לסיכום, טכניקה זו שימושית מאוד להערכה בו זמנית של מיני חמצן תגובתי, תאים חיים ומתים בתרבות אירועים חיה ונורמלית. טכניקה זו שימושית גם להערכה מוגבלת של מיני חמצן תגובתי, תאים חיים ומתים, בתרבויות ארוכות טווח אשר נחשפו סוכני נזק לתאים שונים כגון קרינה אולטרה סגולה, או חומרים כימיים.
טכניקה זו יכולה גם להנחות חוקר לקביעת הזמן האופטימלי לקצירת התאים כגון ב 50%ROS, 75%ROS, כך וכן הלאה כפי שיכול להיות עבור יישומים רבים במורד הזרם, כגון QR כדי PCR ו כתמים מערביים.
