Olá a todos, meu nome é Dr. Bipasha Bose. Trabalho como professor associado e responsável no Centro de Células-Tronco e Medicina Regenerativa, Centro de Pesquisa Yenepoya, Universidade de Yenepoya, Mangalore, Índia. Agora vamos demonstrar como detectar a presença de ROS ou seja, espécies de oxigênio reativos" nas culturas vivas das superfícies oculares do rato que foram expostas a várias doses de radiação ultravioleta-C.
A vantagem dessa técnica é que aqui podemos detectar simultaneamente a presença de espécies reativas de oxigênio, células vivas e mortas, sem a necessidade de ter células Vester. O princípio desta técnica está essencialmente na permeabilidade celular viva do corante DCFDA. DCFDA é um corante incolor permeante de célula viva, que durante o estresse oxidativo é agido pelas oxidações intracelulares e é convertido em DCF fluorescente verde.
Assim, a florescence verde nos permite detectar para a presença de espécies reativas de oxigênio nas células vivas. Por outro lado, o iodeto propidium é um corante permeante de células exclusivamente mortas que fluoresce vermelho. É um corante de intercalação rDNA de dupla lagartida.
No entanto, o corante Hoechst é permeante para as células vivas e mortas. É uma mancha nuclear de cor azul. Portanto, este é um método muito simples no qual podemos detectar para a presença de espécies reativas de oxigênio em culturas de longo prazo de forma dependente do tempo, juntamente com a avaliação de células mortas.
Placa aponta dois milhões de células por 35 milímetros de pratos de cultura. As células que estamos aplicando são as células da superfície ocular do rato. Remova o volume máximo de mídia de cada um dos pratos de cultura celular.
Deixe para trás cerca de 500 microliters de mídia de cultura celular em contato próximo com as células. A quantidade mínima de mídia impedirá a secagem das células. No entanto, o objetivo da quantidade mínima de mídia é permitir a máxima penetração da exposição ao UVC.
Pegue as células sob uma fonte UV, pode ser um UV Crosslinker, ou pode ser qualquer outra fonte ultravioleta-C. Exponha as células a diferentes doses de radiação UVC, como uma, 10, 100, 1.000 e 10.000 joules por metro quadrado. Quando as células são expostas à radiação ultravioleta-C, as tampas devem estar na posição aberta.
Isso permitirá a penetração máxima do ultravioleta-C para as células e, portanto, mostrará a dose-resposta ideal das células à radiação ultravioleta-C. Leve as células para o capô de fluxo de ar laminar e reponha cada um dos pratos com dois mililitros de mídia completa. Esta mídia completa contém 20% de soro bovino fetal em DMEM, complementado com suplementos como aminoácidos não essenciais mínimos de 1% mínimo, e também 1% antibiótico que é penicilina e estreptomicina.
Posteriormente, após a reposição com volume máximo, ou seja, dois mililitros de mídia completa, devolva as placas à incubadora e incubar por um período de três horas, a fim de ver os efeitos precoces da radiação ultravioleta-C. Prepare a mídia de coloração de células vivas nos últimos 15 minutos de três horas após a incubação de células UVC. A mídia de coloração é preparada em 10% FBS contendo DMEM pré-aquecido a 37 graus.
Para fazer 10 mililitros de mídia de coloração, primeiro adicione cinco microliter de DCFDA de um estoque de 10 milimôlares para obter uma concentração final de cinco micromolar. Misture bem por pipetting para cima e para baixo. Em segundo lugar, adicione cinco microliter de solução Hoechst a partir de um estoque de 10 miligramas por mL para obter uma concentração final de cinco microgramas por mL.
Agora misture bem se encanar para cima e para baixo. Por último, adicione 200 microliters de iodeto de propidium de um estoque de um miligrama por mL para obter uma concentração final de 20 microgramas por mL. Misture bem por pipetting para cima e para baixo.
Agora a solução de coloração está pronta para uso. Após três horas de incubação após a exposição uvc, remova as placas da incubadora de CO2. Aspire a mídia de cada um dos pratos que foram expostos a várias doses de UVC como um, 10, 100, 1.000 e 10.000 joules por metro quadrado.
Agora adicione dois mililitros de mídia de coloração de células ao vivo recém-preparadas para cada um dos pratos suavemente dos lados dos pratos. Volte as placas para a incubadora de CO2 novamente e incubar por 15 minutos para coloração de células vivas. Após 15 minutos de incubação nos meios de coloração de células vivas, remova a mídia de coloração de cada um dos pratos contendo células expostas a diferentes doses de radiação ultravioleta-C.
Reabastecer as células com dois mililitros de mídia completa. Agora as células estão prontas para serem vistas. Agora coloque as células de controle sob o campo brilhante do imager fluorescente.
As células parecem aparentemente normais, já que são células de controle. Sob o campo azul podemos fluorescing células totais. Sob o campo verde mostra a geração ROS.
Como são células de controle, não há ros gerado. Sob o campo vermelho, as células mortas manchadas de propidium iodide são visíveis. Em seguida, mantenha o UV exposto 100 joules por metro quadrado sob o campo brilhante.
Sob o campo azul, e também podemos ver o número total de células sob o campo azul. No entanto, quando nos expõem ao campo verde, células positivas dcfda são vistas, e também células mortas positivas pi são vistas. Por fim, coloque a dose máxima de UV, ou seja, 10.000 joules por metro quadrado de células expostas, sob o campo brilhante.
Podemos ver morfologia celular anormal. No entanto, sob o campo azul podemos ver células azuis totais. Sob o campo verde, células positivas de fluorescing verde DCFDA são vistas indicando a geração ROS.
Quando as células são expostas ao campo vermelho, todas as células estavam fluorescing vermelho indicando um grande número de morte celular quando as células são tratadas com 10.000 joules por metro quadrado de dosagem UV. Agora organize as imagens capturadas em vários canais em um único painel de imagem composto correspondente às doses ultravioleta-C e controles não expostos. As imagens são organizadas em um único painel em grupo.
Primeiro, o campo brilhante. Segundo, a mancha nuclear azul Hoechst. Terceiro, a mancha de iodeto de propídio quanto aos núcleos mortos.
Em quarto lugar, DCFDA para células positivas ROS. E quinto, a imagem mesclada. Quando olhamos para a primeira e a segunda linha de imagens, que é o controle não exposto e as células expostas à dose de UVC um joule por metro quadrado, observamos que não havia células positivas PI nem ROS que haviam iluminado, indicando assim uma completa ausência de ROS e morte celular em controles não expostos e uma dose tão baixa de UVC de um joule por metro quadrado.
Agora chegando à terceira fileira de imagens compostas das células que foram expostas a 100 joules por metro quadrado. Uma porcentagem muito baixa de células, cerca de 10% foram positivas tanto para pi quanto para DCFDA nesta dose, indicando assim baixa quantidade de geração ROS e morte celular. Agora passamos para uma dose mais alta de exposição à radiação UVC, que é de 1.000 joules por metro quadrado como indicado na quarta fileira da imagem composta.
Aqui, cerca de 70% das células foram positivas para PI e DCFDA. Finalmente, passamos para a maior dose de exposição uvc, que é de 10.000 joules por metro quadrado como representado na quinta fileira da imagem composta. Aqui foram encontrados que quase 100% das células foram positivas tanto para pi quanto para DCFDA, indicando assim uma morte 100% celular e geração ROS nesta dose uvc específica.
Transfira as imagens para o software de imagem. Primeiro abra a imagem azul indicando os núcleos manchados de Hoescht, que é o número total de células. Abra a ferramenta de contagem e clique em cada uma das células uma de cada vez para ter o número.
Agora abra a imagem capturada sob o canal vermelho indicando as células mortas positivas do PI. Abra a ferramenta de contagem e clique em cada uma das manchas vermelhas indicando a contagem para as células mortas positivas pi. Uma vez que a contagem das células mortas acabou, clique nas células capturadas do canal verde e abra a ferramenta de contagem e clique em cada uma das manchas verdes indicando as células que mostram a geração ROS.
Complete a contagem das células verdes capturadas sob o canal verde e, em seguida, usando a fórmula enumerar a porcentagem de morte celular por dano UVC e porcentagem da produção de ROS por dano de UVC. Isso é calculado usando o simples número de fórmula de células positivas de PI, que são as células fluorescentes vermelhas, divididas pelo número de células positivas hoechst multiplicadas por 100. A porcentagem da produção de ROS por dano UV é calculada usando a fórmula, número de células fluorescentes positivas ou verdes, divididas pelo número de células positivas hoechst multiplicadas por 100.
Uma vez que você tenha os dois percentuais, que é a porcentagem de morte celular e a porcentagem da produção de ROS, use esses valores para traçar um gráfico de barras. Eixo X indica a dosagem de UV, enquanto o eixo y indica a porcentagem de células. As barras verdes indicam a porcentagem da geração ROS, enquanto a barra vermelha indica a porcentagem de morte celular.
Após a análise, é evidente que na dose de UVC 100 joules há célula geradora de 10% ROS, bem como uma morte celular de 10%. Considerando que na dose UVC 10 elevou para três joules por metro quadrado, 70% das células apresentaram geração ROS, bem como morte celular. Enquanto na dose mais alta de UVC, que é 10 elevado a quatro joules por metro quadrado, cerca de 100% das células apresentaram morte celular, bem como a produção de ROS.
Assim, pode-se concluir que há uma forte correlação positiva entre a geração ROS e a morte celular. Em conclusão, essa técnica é muito útil para avaliação simultânea de espécies reativas de oxigênio, células vivas e mortas em cultura de eventos ao vivo e normal. Esta técnica também é útil para avaliação limitada de espécies reativas de oxigênio, células vivas e mortas, em culturas de longo prazo que foram expostas a vários agentes prejudiciais celulares, tais como radiação ultravioleta, ou agentes químicos.
E essa técnica também pode orientar um pesquisador para determinar o tempo ideal para a colheita das células em 50% ROS, 75% ROS, assim e assim por diante, como pode haver para muitas aplicações a jusante, como QR para PCR e inchaço ocidental.
