Ciao a tutti, mi chiamo dottor Bipasha Bose. Lavoro come professore associato e responsabile nel Centro di Cellule Staminali e Medicina Rigenerativa, Yenepoya Research Center, Yenepoya University, Mangalore, India. Ora dimostreremo come rilevare per la presenza di ROS cioè specie reattive di ossigeno"nelle colture vive dalle superfici oculari del topo che sono state esposte a varie dosi di radiazioni ultraviolette-C.
Il vantaggio di questa tecnica è che qui possiamo rilevare contemporaneamente la presenza di specie reattive di ossigeno, cellule vive e morte, senza la necessità di avere cellule vester. Il principio di questa tecnica risiede essenzialmente nella permeabilità cellulare viva del colorante DCFDA. La DCFDA è un colorante incolore permeante a cellule vive, che durante lo stress ossidativo viene agito dalle ossidasi intracellulari e viene convertito in DCF fluorescenza verde.
Quindi, la florescenza verde ci consente di rilevare la presenza di specie reattive di ossigeno nelle cellule vive. D'altra parte, lo ioduro di propidio è un colorante permeante a cellule esclusivamente morte che fluoresce rosso. È un colorante intercalante a doppio filamento rDNA.
Tuttavia, il colorante Hoechst è permeante sia per le cellule vive che per le cellule morte. È una macchia nucleare di colore blu. Quindi, questo è un metodo molto semplice in cui possiamo rilevare la presenza di specie reattive di ossigeno nelle colture a lungo termine in modo dipendente dal tempo insieme alla valutazione delle cellule morte.
Punto piatto due milioni di cellule per 35 piatti di coltura millimetri. Le cellule che stiamo applicando sono le cellule della superficie oculare del mouse. Rimuovere il volume massimo di supporti da ciascuno dei piatti di coltura cellulare.
Lasciare circa 500 microlitri di mezzi di coltura cellulare a stretto contatto con le cellule. Una quantità minima di mezzi impedirà l'essiccazione delle cellule. Tuttavia, lo scopo di una quantità minima di supporti è quello di consentire la massima penetrazione dell'esposizione ai raggi UVC.
Prendi le cellule sotto una sorgente UV, può essere un crosslinker UV o può essere qualsiasi altra sorgente ultravioletta-C. Esporre le cellule a diversi dosaggi di radiazioni UVC come uno, 10, 100, 1.000 e 10.000 joule per metro quadrato. Quando le cellule si sono esposte alla radiazione ultravioletta-C, i coperchi dovrebbero essere in posizione aperta.
Ciò consentirà la massima penetrazione dell'ultravioletto-C alle cellule e quindi mostrerà la risposta ottimale della dose delle cellule alla radiazione ultravioletta-C. Portare le cellule nella cappa di flusso d'aria laminare e reintegrare ciascuno dei piatti con due millilitri di mezzi completi. Questo supporto completo contiene il 20% di siero bovino fetale in DMEM, integrato con integratori come l'1% di amminoacidi non essenziali minimi e anche l'1% di antibiotico che è penicillina e streptomicina.
Successivamente, dopo aver rifornito con il massimo volume, cioè due millilitri di mezzo completo, riportare le piastre nell'incubatrice e incubare per un periodo di tre ore al fine di vedere i primi effetti della radiazione ultravioletta-C. Preparare il supporto di colorazione delle cellule vive negli ultimi 15 minuti di incubazione cellulare post UVC di tre ore. I supporti di colorazione sono preparati in FBS al 10% contenenti DMEM preri warmed a 37 gradi.
Per realizzare 10 millilitri di mezzi di colorazione, aggiungere prima cinque microlitri di DCFDA da uno stock di 10 millimolare in modo da ottenere una concentrazione finale di cinque micromolari. Mescolare bene pipettando su e giù. In secondo luogo, aggiungere cinque microlitri di soluzione hoechst da uno stock di 10 milligrammi per mL per ottenere una concentrazione finale di cinque microgrammi per mL.
Ora mescolare bene pipettando su e giù. Aggiungere infine 200 microlitri di ioduro di propidio da uno stock di un milligrammo per mL per ottenere una concentrazione finale di 20 microgrammi per mL. Mescolare bene pipettando su e giù.
Ora la soluzione di colorazione è pronta per l'uso. Dopo tre ore di esposizione post UVC di incubazione, rimuovere le piastre dall'incubatore di CO2. Aspirare i supporti da ciascuno dei piatti che sono stati esposti a vari dosaggi di UVC come uno, 10, 100, 1.000 e 10.000 joule per metro quadrato.
Ora aggiungi due millilitri di supporti di colorazione delle cellule vive preparati al momento a ciascuno dei piatti delicatamente dai lati dei piatti. Riportare nuovamente le piastre all'incubatore di CO2 e incubare per 15 minuti per la colorazione delle cellule vive. Dopo 15 minuti di incubazione nel mezzo di colorazione delle cellule vive, rimuovere il mezzo di colorazione da ciascuno dei piatti contenenti cellule esposte a diverse dosi di radiazioni ultraviolette-C.
Reintegrare le cellule con due millilitri di supporto completo. Ora le celle sono pronte per la visualizzazione. Ora posiziona le celle di controllo sotto il campo luminoso dell'imager fluorescente.
Le cellule sembrano apparentemente normali poiché sono celle di controllo. Sotto il campo blu possiamo le cellule totali fluorescenti. Sotto il campo verde mostra la generazione ROS.
Poiché si tratta di celle di controllo, non viene generato alcun ROS. Sotto il campo rosso, sono visibili le cellule morte macchiate di propidio ioduro. Quindi tenere i raggi UV esposti 100 joule per metro quadrato sotto il campo luminoso.
Sotto il campo blu, e possiamo anche vedere il numero di cella totale sotto il campo blu. Tuttavia, quando esponiamo al campo verde, si vedono cellule positive DCFDA e si vedono anche cellule morte positive PI. Infine, posizionare la dose massima UV, o cioè 10.000 joule per metro di celle quadrate esposte, sotto il campo luminoso.
Possiamo vedere morfologia cellulare anomala. Tuttavia, sotto il campo blu possiamo vedere le celle blu totali. Sotto il campo verde, si vedono cellule positive DCFDA fluorescenti verdi che indicano la generazione di ROS.
Quando le cellule sono esposte al campo rosso, tutte le cellule erano rosse fluorescenti indicando un gran numero di morte cellulare quando le cellule vengono trattate con 10.000 joule per metro quadrato di dosaggio UV. Ora disporre le immagini catturate in vari canali in un unico pannello immagine composito corrispondente alle dosi ultraviolette-C e ai controlli non esposti. Le immagini sono disposte in un unico pannello in gruppo.
In primo luogo, il campo luminoso. In secondo luogo, la macchia nucleare blu di Hoechst. In terzo luogo, la colorazione dello ioduro di propidio come per i nuclei morti.
Quarto, DCFDA per le cellule positive del ROS. E quinto, l'immagine unita. Quando osserviamo la prima e la seconda fila di immagini, cioè il controllo non esposto e le cellule esposte alla dose UVC di un joule per metro quadrato, abbiamo osservato che non c'erano né cellule positive PI né ROS che si erano illuminate, indicando così una completa assenza di ROS e morte cellulare in controlli non esposti e una dose UVC così bassa di un joule per metro quadrato.
Ora arrivando alla terza fila di immagini composite delle celle che sono state esposte a 100 joule per metro quadrato. Una percentuale molto bassa di cellule, circa il 10% era positiva sia per PI che per DCFDA a questa dose, indicando così una bassa quantità di generazione di ROS e morte cellulare. Ora passiamo a un'ulteriore dose più elevata di esposizione alle radiazioni UVC, cioè 1.000 joule per metro quadrato come indicato nella quarta fila dell'immagine composita.
Qui, circa il 70% delle cellule erano positive per PI e DCFDA. Infine, passiamo alla più alta dose di esposizione AIC, cioè 10.000 joule per metro quadrato come rappresentato nella quinta fila dell'immagine composita. Qui si è trovato che quasi il 100% delle cellule era positivo sia per PI che per DCFDA, indicando così una morte cellulare del 100% e una generazione di ROS a questa particolare dose UVC.
Trasferire le immagini al software di imaging. Aprire innanzitutto l'immagine blu che indica i nuclei macchiati di Hoescht, o cioè il numero totale di celle. Aprire lo strumento di conteggio e fare clic su ciascuna delle celle una alla volta per avere il numero.
Aprire ora l'immagine acquisita sotto il canale rosso che indica le celle morte positive pi greco. Aprire lo strumento di conteggio e fare clic su ciascuna delle macchie rosse che indicano il conteggio per le celle morte positive PI. Una volta finito il conteggio delle celle morte, fare clic sulle celle acquisite del canale verde e aprire lo strumento di conteggio e fare clic su ciascuna delle macchie verdi che indicano le celle che mostrano la generazione ros.
Completare il conteggio delle celle verdi catturate sotto il canale verde, quindi utilizzando la formula enumerare la percentuale di morte cellulare per danno UVC e la percentuale di produzione di ROS per danno UVC. Questo viene calcolato usando il semplice numero di formule di cellule positive PI, cioè le cellule fluorescinti rosse, divise per numero di cellule positive di Hoechst moltiplicate per 100. La percentuale di produzione di ROS per danno UV viene calcolata utilizzando la formula, il numero di cellule DCFDA positive o verdi fluorescenza, divise per il numero di cellule positive hoechst moltiplicate per 100.
Una volta che si dispone di entrambe le percentuali, o cioè la percentuale di morte cellulare e la percentuale di produzione ROS, utilizzare questi valori per tracciare un grafico a barre. L'asse X indica il dosaggio dei raggi UV, mentre l'asse y indica la percentuale di cellule. Le barre verdi indicano la percentuale di generazione del ROS, mentre la barra rossa indica la percentuale di morte cellulare.
Dopo l'analisi, è evidente che alla dose UVC 100 joule c'è una cellula generatrice 10%ROS e una morte cellulare del 10%. Mentre alla dose UVC 10 è elevata a tre joule per metro quadrato, il 70% delle cellule ha mostrato la generazione di ROS e la morte cellulare. Mentre alla dose più alta di UVC, cioè 10 portato a quattro joule per metro quadrato, circa il 100% delle cellule ha mostrato la morte cellulare e la produzione di ROS.
Quindi, si può concludere che esiste una forte correlazione positiva tra la generazione del ROS e la morte cellulare. In conclusione, questa tecnica è molto utile per la valutazione simultanea di specie reattive dell'ossigeno, cellule vive e morte in coltura di eventi vivi e normali. Questa tecnica è utile anche per una valutazione limitata delle specie reattive dell'ossigeno, delle cellule vive e morte, in colture a lungo termine che sono state esposte a vari agenti dannosi per le cellule come le radiazioni ultraviolette o gli agenti chimici.
E questa tecnica può anche guidare un ricercatore per determinare il tempo ottimale per la raccolta delle cellule come 50%ROS, 75%ROS, così e così via come ci possono essere per molte applicazioni a valle, come QR a PCR e western blotting.
