כאן, אנו מציגים פרוטוקול לגילוי 5-hydroxymethylcytosin בתאים ורקמות המוח באמצעות immunofluorescence, השיטה החדשה, ואת כתם נקודה DNA. 5-hydroxymethylcytosin, כלומר 5hmC, שינוי אפיגנטי מקל, ממלא תפקיד חשוב בוויסות ביטוי גנים ומעורב בהפרעות נוירולוגיות מרובות.
למעשה, השיטות שלנו ניתן להשתמש כדי לזהות 5hmC בתאים מרובים ואת הרקמות. זה נוח ו ניתן לבצע עם ציוד משותף במעבדה. התחל על ידי מיקום העכבר עם הפנים כלפי מעלה על לוח פלסטיק ותיקון כל איבר עם סרט דביק.
השתמש מספריים כירורגיים לחתוך דרך העור והשרירים, ולפתוח את חלל בית החזה. לחשוף את הלב ולנתק חלק קטן של אטריום הנכון עם מספריים כירורגיים עדין. באמצעות מזרק חד פעמי 10 מיליליטר, מעוקר, לבלבל את העכבר מן החדר השמאלי עם PBS קר.
לאחר מכן, לבלבל את העכבר עם 4%PFA עד שהוא נוקשה. לאחר מכן, לפתוח את הגולגולת עם מאלץ עצם ולהסיר את המוח. מניחים את המוח לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר מלא חמישה מיליליטר של 4% PFA ולאחסן אותו בארבע מעלות צלזיוס.
לאחר 24 שעות, מעבירים את המוח לתסיסה של 30% סוכרוז ומשאירים אותו בארבע מעלות צלזיוס להתייבשות מוחלטת. לפני החיתוך, דפק את המוח בתרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית וקירור למינוס 20 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת לפחות. דגימות מוח חתוכות בעובי של 20 עד 40 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום קריוסטט.
לאסוף קטעים לתוך PBS ולאחסן בארבע מעלות צלזיוס. להרים את חלקי המוח של עניין ולשים אותם לתוך צלחת 24 גם עם PBS. לשטוף חלקים עם PBS על שייקר במשך 10 דקות.
מוציאים את ה-PBS ומטפלים בחומצה הידרוכלורית חד-טוחנית שחומם מראש ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. חומצה הידרוכלורית היא קורוזיבית ובבקשה להכין אותו בהמתנה כימית. לאחר מכן, לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS במשך חמש דקות ולחסום אותם עם PBS המכיל 3% סרום עזים נורמלי ו 0.1% טריטון X-100.
השאירו את הדגימות על שייקר בטמפרטורת החדר למשך שעה. מוסיפים נוגדנים ראשוניים ספציפיים למקטעים ו דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס על שייקר. למחרת, להוציא את הדגימות ולהשאיר אותם בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת.
לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS ולהוסיף נוגדנים משניים. מכסים את הצלחת עם אלומיניום ולהשאיר אותו בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת תוך כדי רעידות. לאחר הדגירה, לשטוף את הדגימות שלוש פעמים עם PBS ולהרים אותם על שקופיות.
הוסיפו 100 עד 150 מיקרוליטרים של מדיום הרכבה נגד עמעום, מכסים בזכוכית כיסוי פרימיום וחותמים עם לק. תדמיין את חלקי המוח במיקרוסקופ רגיל או קונפוקל. כדי לבודד דנ"א גנומי, התחל על ידי ניתוח רקמות ההיפוקמפוס, קליפת המוח והקטנה על צלחת מקורר קרח.
מוסיפים מיליליטר אחד של חיץ תות DNA וטוחנים את הרקמות. מעבירים את הדגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי ומוסיפים 250 מיקרוגרם חלבון-K לכל 600 מיקרוליטר של מאגר תמוגה. לאחר מכן, מוסיפים כ-50 מיקרוגרם של RNase A לדגימה ודגירה למשך 12 שעות לפחות ב-37 מעלות צלזיוס.
לאחר הדגירה, מוסיפים נפח שווה של פנול כלורופורם isoamyl אלכוהול ומערבבים ביסודיות. צנטריפוגה את התערובת על פי הוראות כתב יד ולהעביר את supernatant לצינור חדש. מוסיפים 600 מיקרוליטרים של כלורופורם לעל-טבעי, מערבבים ביסודיות וצנטריפוגה לפי הוראות כתב היד.
מעבירים את העל-טבעי לצינור חדש ומוסיפים 500 מיקרוליטרים של isopropanol. מערבבים ביסודיות וצנטריפוגה שוב כדי לזרז את ה-DNA. לאחר הצנטריפוגה, השליכו את העל-טבעי, ושטפו את גלולת הדנ"א ב-70% אתנול בהתאם לכיווני כתב היד.
אוויר לייבש את גלולת ה-DNA לחלוטין ולאחר מכן, להמיס אותו במאגר טריס-HCl. לפני ההתחלה, הכינו את הפתרונות הנדרשים ודגמו תערובת לפי הוראות כתב היד. Denature דגימת ה-DNA על ידי חימום זה 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ולאחר מכן, למקם אותו על קרח.
חותכים את הגודל המתאים של קרום ניילון ולשטוף אותו עם 6X SSC. מניחים את הממברנה על מנגנון כתם נקודה ולחבר את משאבת ואקום. ספוט שש נקודות microliter על הממברנה ולהכליל במשך 30 דקות ב 80 מעלות צלזיוס.
לאחר מכן, לחסום את הממברנה מדגם עם חלב ללא שומן מלוחים טריס-buffered, או TBS, במשך שעה אחת. מוסיפים את נוגדן הארנב הפולקלונאלי נגד 5-הידרוקסימטילציטוסין לממברנה ומצטיידים במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס. למחרת, להשאיר את הממברנה מדגם בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת, ולאחר מכן לשטוף את הממברנה שלוש פעמים עם TBS.
דגירה הממברנה עם נוגדן משני נגד ארנב במשך 30 דקות ולאחר מכן, לשטוף שלוש פעמים עם TBS. לדמיין את אותות chemiluminescence לכמת את עוצמתם. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לדמיין 5-hydroxymethylcytosin, או 5hmC, בהיפוקמפוס של עכברים בוגרים.
Immunofluorescence עם נוגדנים נגד תאים עצביים, 5hmC מגלה כי יש העשרה של 5hmC בנוירונים. דינמיקה של 5hmC במהלך התפתחות עצבית ניתן לקבוע עם מבחנה נקודה כתם של דגימות DNA מבודדים מתרבים ומובחנים תאי גזע עצביים למבוגרים. רמות גלובליות של 5hmC להגדיל באופן משמעותי במהלך ההידול ואת הרמה של 5hmC בנוירונים גבוה יותר מאשר בתאי גזע עצביים.
השלב העיקרי בשיטה זו הוא לוודא כי denaturation מלא של דגימות DNA.
