Здесь мы представляем протокол для обнаружения 5-гидроксиметилцитозина в клетках и тканях мозга с использованием иммунофторесценции, нового метода и точечной помарки ДНК. 5-гидроксиметилцитозин, т.е. 5hmC, смягченная эпигенетическая модификация, играет важную функцию в регулировании экспрессии генов и участвует в многочисленных неврологических расстройствах.
На самом деле, наши методы могут быть использованы для обнаружения 5hmC в нескольких клетках и тканях. Это удобно и может быть выполнено с общим оборудованием в лаборатории. Начните с позиционирования мыши лицом вверх на пластиковой доске и фиксации каждой конечности с липкой лентой.
Используйте хирургические ножницы, чтобы прорезать кожу и мышцы, и открыть грудную полость. Выставить сердце и отрезать небольшую часть правого атриума с мелкими хирургическими ножницами. Используя 10-миллилитровый одноразовый, стерилизованный шприц, пронизывает мышь из левого желудочка холодным PBS.
Затем, perfuse мыши с 4%PFA, пока она не жесткая. Затем откройте череп костными мипсами и удалите мозг. Поместите мозг в 15-миллилитровую центрифугу, наполненную пятью миллилитровами 4%PFA, и храните ее при четырех градусах Цельсия.
Через 24 часа перенесите мозг в 30%-ный раствор сахарозы и оставьте его при четырех градусах Цельсия для полного обезвоживания. Перед секцией, imbed мозга в оптимальной резки температурного соединения и остыть до минус 20 градусов по Цельсию, по крайней мере один час. Образцы мозга секции толщиной от 20 до 40 микрометров с использованием микротома криостата.
Соберите разделы в PBS и хранить при четырех градусах по Цельсию. Возьмите секции мозга интерес и положить их в 24-хорошо пластины с PBS. Вымойте секции с PBS на шейкере в течение 10 минут.
Удалить PBS и лечить с разогретой однояролярной соляной кислотой при 37 градусах по Цельсию в течение 30 минут. Гидрохлорная кислота коррозионная и, пожалуйста, подготовить его в химическом холде. Затем, мыть образцы три раза с PBS в течение пяти минут и блокировать их с PBS, содержащий 3%нормальной сыворотки козы и 0,1%Triton X-100.
Оставьте образцы на шейкере при комнатной температуре на один час. Добавить конкретные первичные антитела к разделам и инкубировать на ночь при четырех градусах по Цельсию на шейкере. На следующий день, взять образцы и оставить их при комнатной температуре в течение одного часа.
Вымойте образцы три раза с PBS и добавить вторичные антитела. Обложка пластины с алюминием и оставить его при комнатной температуре в течение одного часа во время встряхивания. После инкубации, мыть образцы три раза с PBS и смонтировать их на слайды.
Добавьте от 100 до 150 микролитров антиутухающей монтажной среды, накройте стеклом премиум-крышки и запечатайте лаком для ногтей. Изображение секций мозга с помощью обычного или конфокального микроскопа. Чтобы изолировать геномную ДНК, начните с вскрытия тканей гиппокампа, коры головного мозга и мозжечка на охлаждено льдом.
Добавьте один миллилитр буфера лиза ДНК и измельчите ткани. Перенесите образец в чистую микроцентрифугную трубку и добавьте 250 микрограммов протеиназы-K на каждые 600 микролитров буфера лиза. Затем добавьте около 50 микрограммов RNase A на образец и инкубировать в течение по крайней мере 12 часов при 37 градусах по Цельсию.
После инкубации добавьте равное количество фенола хлороформного изомильного спирта и тщательно перемешайте. Центрифугать смесь в соответствии с рукописными указаниями и перенести супернатант в новую трубку. Добавьте 600 микролитров хлороформа в супернатант, тщательно перемешайте и центрифугу в соответствии с рукописными указаниями.
Перенесите супернатант в новую трубку и добавьте 500 микролитров изопропанола. Смешайте тщательно и центрифуги снова осаждать ДНК. После центрифугации отбросьте супернатант и вымойте гранулы ДНК 70%этанолом в соответствии с рукописными указаниями.
Воздух полностью высушит гранулы ДНК, а затем растворит их в буфере Tris-HCl. Перед началом подготовь необходимые растворы и образец смеси в соответствии с рукописными указаниями. Денатуратурный образец ДНК, нагревая его до 100 градусов по Цельсию в течение 10 минут, а затем, поместите его на лед.
Вырезать соответствующий размер нейлоновой мембраны и промыть его 6X SSC. Поместите мембрану на точечный аппарат и соедините вакуумный насос. Найди шесть микролитровых точек на мембрану и гибридизуйте в течение 30 минут при 80 градусах Цельсия.
Затем на один час заблокините мембрану образца обезжиреваемым молоком и солевым раствором Tris-buffered, или TBS. Добавить поликлонального кролика анти-5-гидроксимилцитозин антитела к мембране и инкубировать на ночь при четырех градусах по Цельсию. На следующий день оставьте пробную мембрану при комнатной температуре на один час, затем трижды промыте мембрану TBS.
Инкубировать мембрану с анти-кролика вторичного антитела в течение 30 минут, а затем, мыть три раза с TBS. Визуализация сигналов хемилюминесценции и количественно их интенсивности. Этот протокол может быть использован для визуализации 5-гидроксиметилцитозин, или 5hmC, в гиппокампе взрослых мышей.
Иммунофторесценция с антителами против нейронных клеток, 5hmC показывает, что есть обогащение 5hmC в нейронах. Динамика 5hmC во время развития нейронов может быть определена с точкой пятно анализ образцов ДНК изолированы от распространения и дифференцированных взрослых нервных стволовых клеток. Глобальные уровни 5hmC значительно увеличиваются во время дифференциации и уровень 5hmC в нейронах выше, чем в нервных стволовых клетках.
Ключевым шагом этого метода является убедиться, что полная денатурация образцов ДНК.
