Aqui, apresentamos um protocolo para detectar 5-hidroximetilcytosina nas células e nos tecidos cerebrais usando imunofluorescência, o novo método, e o dna ponto-mancha. 5-hidroxietilcytosina, ou seja, 5hmC, modificação epigenética atenuada, desempenha importante função na regulação da expressão genética e envolvida em múltiplos distúrbios neurológicos.
Na verdade, nossos métodos podem ser usados para detectar 5hmC em múltiplas células e tecidos. É conveniente e pode ser realizado com equipamentos comuns no laboratório. Comece posicionando o rosto do mouse em uma placa de plástico e fixando cada membro com fita adesiva.
Use uma tesoura cirúrgica para cortar a pele e o músculo, e abrir a cavidade torácica. Exponha o coração e corte uma pequena parte do átrio direito com uma tesoura cirúrgica fina. Usando uma seringa descartável de 10 mililitros, esterilizada, perfunda o mouse do ventrículo esquerdo com PBS frio.
Em seguida, perfunde o mouse com 4%PFA até que ele esteja duro. Então, abra o crânio com fórceps ósseos e remova o cérebro. Coloque o cérebro em um tubo de centrífuga de 15 mililitros cheio de cinco mililitros de 4% PFA e armazene-o a quatro graus Celsius.
Após 24 horas, transfira o cérebro para uma solução de 30% de sacarose e deixe-o a quatro graus Celsius para desidratação completa. Antes da secção, embebedou o cérebro em um composto de temperatura de corte ideal e esfriou para menos 20 graus Celsius por pelo menos uma hora. Seção amostras cerebrais com uma espessura de 20 a 40 micrômetros usando um microtome criostat.
Colete seções na PBS e armazene a quatro graus Celsius. Pegue as seções cerebrais de interesse e coloque-as em uma placa de 24 poços com PBS. Lave as seções com PBS em um shaker por 10 minutos.
Retire o PBS e trate com ácido clorídrico de um molar pré-aquecido a 37 graus Celsius por 30 minutos. O ácido clorídrico é corrosivo e, por favor, prepare-o no porão químico. Em seguida, lave as amostras três vezes com PBS por cinco minutos e bloqueie-as com PBS contendo soro de cabra 3% normal e 0,1% Triton X-100.
Deixe as amostras em um agitador à temperatura ambiente por uma hora. Adicione anticorpos primários específicos às seções e incubar durante a noite a quatro graus Celsius em um shaker. No dia seguinte, pegue as amostras e deixe-as em temperatura ambiente por uma hora.
Lave as amostras três vezes com PBS e adicione anticorpos secundários. Cubra a placa com alumínio e deixe-a em temperatura ambiente por uma hora enquanto treme. Após a incubação, lave as amostras três vezes com PBS e monte-as em slides.
Adicione 100 a 150 microliters de meio de montagem anti-fade, cubra com um vidro de cobertura premium e vedação com esmalte. Imagem as seções cerebrais com um microscópio regular ou confocal. Para isolar o DNA genômico, comece dissecando os tecidos de hipocampo, córtex e cerebelo em um prato refrigerado ao gelo.
Adicione um mililitro de tampão de dna e triture os tecidos. Transfira a amostra para um tubo de microcentrifuuge limpo e adicione 250 microgramas de proteinase-K para cada 600 microliters de tampão de lise. Em seguida, adicione cerca de 50 microgramas de RNase A por amostra e incubar por pelo menos 12 horas a 37 graus Celsius.
Após a incubação, adicione um volume igual de álcool isoamílico de clorofórmio fenol e misture bem. Centrifugar a mistura de acordo com as instruções do manuscrito e transferir o supernatante para um novo tubo. Adicione 600 microlitadores de clorofórmio ao supernanato, misture bem e centrífuga de acordo com as instruções do manuscrito.
Transfira o supernatante para um novo tubo e adicione 500 microliters de isopropanol. Misture bem e centrífuga novamente para precipitar o DNA. Após a centrifugação, descarte o supernasce, e lave a pelota de DNA com 70% de etanol de acordo com as instruções do manuscrito.
O ar secou completamente a pelota de DNA e, em seguida, dissolvê-la em tampão Tris-HCl. Antes de começar, prepare as soluções necessárias e a mistura de amostras de acordo com as instruções do manuscrito. Desnaturar a amostra de DNA aquecendo-a a 100 graus Celsius por 10 minutos e, em seguida, colocá-la no gelo.
Corte o tamanho apropriado de uma membrana de nylon e enxágue-a com 6X SSC. Coloque a membrana em um aparelho de mancha de ponto e conecte a bomba de vácuo. Detectar pontos de seis microliter na membrana e hibridizar por 30 minutos a 80 graus Celsius.
Em seguida, bloqueie a membrana amostral com leite sem gordura e soro fisiológico tris-tampão, ou TBS, por uma hora. Adicione o anticorpo anti-5-hidroxitilcitomitosina do coelho policlonal à membrana e incubar durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, deixe a membrana amostral à temperatura ambiente por uma hora, depois lave a membrana três vezes com TBS.
Incubar a membrana com o anticorpo secundário anti-coelho por 30 minutos e, em seguida, lavar três vezes com TBS. Visualize os sinais de chemiluminescência e quantifique sua intensidade. Este protocolo pode ser usado para visualizar 5-hidroxietilcitose, ou 5hmC, no hipocampo de camundongos adultos.
Imunofluorescência com anticorpos contra células neuronais, o 5hmC revela que há um enriquecimento de 5hmC nos neurônios. A dinâmica de 5hmC durante o desenvolvimento neuronal pode ser determinada com um ensaio de manchas de ponto de amostras de DNA isoladas da proliferação e células-tronco neurais adultas diferenciadas. Os níveis globais de 5hmC aumentam significativamente durante a diferenciação e o nível de 5hmC em neurônios é maior do que em células-tronco neurais.
O passo chave deste método é garantir a desnaturação completa das amostras de DNA.
