שיטה זו היא משמעותית מכיוון ששום פרוטוקול אחר אינו מאפשר לנתח RNA מסונתז חדש בסולם זמן כה קצר, ולאפשר ניסויים במרדף אחר דופק עם דופק כה קצר. פרוטוקול זה פועל היטב עם דלדול חלבונים, כגון פרוטוקול BEST AID 4U. היתרון העיקרי הוא שהרקע נמוך.
זה מאפשר את זמני התיוג הקצרים, על ידי הסרת כמעט כל RNA nonthiolated. הפרוטוקול הכתוב מפרט גם סוגים רבים ושונים של ניסויים שניתן לבצע וכיצד לשלב אותם בטכניקה זו. כדי להתחיל בהליך זה, לגדל שמרים בינוני YMM ל OD 600 בין 0.6 ו 0.8.
במכסה המנוע של האדים, הוסיפו מתנול השווה ל-30 עד 50% מנפח הדגימה המיועד לצינור של 50 מיליליטר. סוגרים את הצינורות בחוזקה, מתייגים אותם ומ מניחים אותם על קרח יבש כדי לצנן. לאחר מכן, סמן שני צינורות מיליליטר לאחסון לטווח ארוך של הדגימות והנח על קרח כדי להתקרר.
מוסיפים גם גם זירקוניה לשני צינורות המיליליטר. מצננים לפחות מיליליטר מים לדגימה על קרח. אם יש להוסיף ספייק S.pombe לתרבות, מניחים aliquot של תאי S.pombe thiolated על קרח להפשיר.
וורטקס ההפשרה והוסיף אותה לתרבות. לאחר מכן מוסיפים 4tU לתרבות לריכוז של 10 מיקרומולרים ומערבבים במרץ. Thio-label לאורך זמן בין 15 שניות לחמש דקות.
קח דגימות של התרבות במרווחי זמן קבועים לסוף קורס הזמן. מוסיפים כל דגימה לאחד מצינורות הצנטריפוגה המוכנים המכילים מתנול. לאטום כל צינור, לנער לערבב ביסודיות, ומקום על קרח יבש.
ברגע שכל הדגימות נלקחו, שים את כולם על קרח. ודא שאף אחת מהדגימות לא קפאה. אם יש להקפיא, לחמם אותם בעדינות ביד תוך היפוך מתמיד.
צנטריפוגה התאים ב 3, 000 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך שתי דקות כדי גלולה את התאים. יוצקים את הנוזל, ו resuspend את גלולה לפחות מיליליטר אחד של מים קרים קרח על ידי צינורות במרץ למעלה ולמטה. מעבירים את ההשעיה לצינור כובע הבורג המוכן ומ מניחים את הצינור על קרח.
צנטריפוגה הדגימות לזמן קצר במהירות גדולה מ 13, 000 פעמים g כדי מחדש גלולה את התאים. ואז למקם אותם בחזרה על קרח, ולהסיר את הנוזל. ראשית, להוסיף 400 microliters של מאגר AE, 40 microliters של SDS, ו 800 microliters של פנול ב pH נמוך.
יש להתריע מחדש על ידי מערבולת למשך 10 שניות. ואז lyse התאים homogenizer במשך שלוש שתי דקות צרורות בהגדרת הכוח הנמוכה ביותר. השאירו את הדגימות על הקרח לשתי דקות בין פולסים הומוגניזציה.
מניחים את התאים lysed על קרח יבש במשך חמש דקות עד שהוא מתגבש. לאחר מכן, השתמש microcentrifuge לסובב את התאים במהירות מעל 13, 000 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, לבצע מיצוי פנול כלורופורם וחילוץ כלורופורם כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
מוסיפים בין 1/3 ל 1/2 של נפח של 10 ליתיום כלוריד טוחן ומערבבים כדי לזרז את RNA. צנטריפוגה במהירות מעל 13,000 פעמים g במשך חמש דקות. הסר את הנוזל, ולסובב מחדש בקצרה את המדגם כדי להסיר את dregs.
לאחר מכן, לשטוף את גלולה עם 300 כדי 500 microliters של 70% אתנול. צנטריפוגה גלולה שטף בקצרה, ולהסיר כל אתנול שנותר. ממיסים מחדש את גלולת ה-RNA ב-90 מיקרוליטרים של TE ב-pH 7.0 על ידי חימום ב-65 מעלות צלזיוס תוך כדי רעידות.
לאחר בדיקת מינון RNA מלא, להעביר את ההשעיה לצינור 0.2 מיליליטר. כדי להתחיל, biotinylate על ידי הוספת 10 microliters של פתרון HPDP-ביוטין ל- RNA ומערבבים ביסודיות. דגירה בחושך ב 65 מעלות צלזיוס במשך 15 עד 30 דקות.
לאחר מכן, הכן אמצעי אחסון קטן של שרפין, עמודת אי-הכללת גודל כדי לא לכלול את הביוטין הלא מאוגד. הסר את התג התחתון של העמודה, שחרר את המכסה והצב את העמודה בצינור צנטריפוגה של שני מיליליטר. צנטריפוגה ב 1, 500 פעמים גרם לדקה אחת כדי לשטוף את המאגר ולהשליך את הזרימה דרך.
לאחר מכן הוסף בעדינות 0.3 מיליליטר של TE לראש העמודה וסובב שוב באמצעות אותם תנאים. מעבירים את העמוד השטוף לצינור טרי של 1.5 מיליליטר. לאחר השלמת הדגירה לדוגמה, הוסף את הדוגמה לראש העמודה.
צנטריפוגה ב 1, 500 פעמים גרם במשך שתי דקות, עוזב את מדגם RNA biotinylated בתחתית הצינור. מחק את העמודה. ולהוסיף 1/3 ל 1/2 נפח של 10 ליתיום כלוריד טוחן לצינור המכיל את המדגם.
מערבבים כדי לזרז מחדש את ה-RNA. ראשית, ממיסים מחדש את ה-RNA ב-200 מיקרוליטרים של מים שטופלו ב-DEPC. למדוד את ריכוז RNA, ולחשב כרכים עבור כל מדגם זה ייתן כמויות שוות של RNA עבור כל הדגימות.
הוסף כמות זו של RNA לצינור טרי, והוסף מים שטופלו ב- DEPC בחזרה לנפח כולל של 200 מיקרוליטרים. כאשר מדגם הוא בטמפרטורת החדר, להוסיף 25 microliters של 10 x מאגר NaTM, 25 microliters של נתרן פוספט טוחן אחד, ו 2.5 microliters של 10% SDS. מערבבים היטב, וצנטריפוגה בעדינות בערך 100 פעמים g במשך פחות מ 30 שניות.
הכן שני מיליליטר של מאגר חרוזים עבור כל מדגם עם מאגר NaTM אחד, 0.1 נתרן פוספט טוחן, ו 0.1% SDS. הוסף 50 microliters של חרוזים סטרפטבידין לצינור שימור נמוך 1.5 מיליליטר. מניחים את הצינור על המדף המגנטי ומחכים עד שהחורוזים יתיישבו.
לאחר מכן, להסיר את הנוזל על ידי שאיפה. כדי לשטוף את חרוזים, להוסיף 200 מיליליטר של חיץ חרוזים ומערבולת עד גלולת חרוזים הוא resuspended באופן מלא. צנטריפוגה הצינור בערך 100 פעמים g לכל היותר חמש שניות.
מניחים את הצינור במתלה המגנטי כדי לאפשר את חרוזים להיתפס על ידי המגנט. הסר את הנוזל על ידי שאיפה אם יש מספר קטן של דגימות. יוצקים את הנוזל ולאחר מכן שאף אם יש דגימות רבות.
חסום עם 200 מיקרוליטרים של חיץ חרוזים, 10 מיקרוליטרים של גליקוגן ו-2.5 מיקרוליטרים של tRNA. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות תוך סיבוב סוף מעל סוף במהירות מתונה. לאחר מכן, הסר את הנוזל ושטף שוב, כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
יש למפות את החמרוזים בדגימה, ולהדגור בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות תוך כדי סיבוב. במהלך הדגירה הזו, הכינו צינור טרי של 1.5 מיליליטר לכל דגימה. הוסף 1/10 נפח של שלושה אצטט נתרן טוחן ב pH 5.3 ו 20 מיקרוגרם של גליקוגן.
צנטריפוגה בערך 100 פעמים g במשך שלוש שניות. הסר את ה- RNA הלא מאוגד מהחרוזים ושטף אותם כמפורט בפרוטוקול הטקסט. כדי לסלק את ה-RNA, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של בטא מרפטנול בטא טרי שהוכן טרי לחרוזים.
לאחר מערבולת וצנטריפוגה, מניחים את תרחיף במדף המגנטי. פיפטה RNA המכיל פתרון לתוך צינורות צנטריפוגה 1.5 מיליליטר מוכן. אלוט פעם נוספת כפי שתואר קודם לכן.
לאחר מכן, מניחים את המדגם בחזרה במתלה המגנטי כדי להסיר שאריות חרוזים מן RNA אלוט ולהעביר את הנוזל טרי, כריכה נמוכה 0.5 צינור צנטריפוגה מיליליטר. מערבבים את הדגימה. ולאחר מכן להוסיף 2.5 כרכים של אתנול כדי לזרז nsRNA.
לאחר ערבוב ודגירה, צנטריפוגה במהירות של לפחות 13, 000 פעמים g ו ב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. תשואות אופייניות עבור snRNA התאושש באמצעות פרוטוקול זה מוצגים כאן. שים לב כי התאוששות RNA בנקודת זמן אפס הוא חלק קטן מאוד של זה התאושש מנקודות זמן ארוכות יותר עם רק 0.3 מיקרוגרם של RNA להיות התאושש מכ 30 מיליארד תאים.
לאחר רק 30 שניות של תיוג, עם זאת, מעל פי שניים RNA נאסף מאותו מספר של תאים. בעקבות הביואנליזה, ניתן לראות את מבשרי הרנ"א שלנו כשיא ליד 1,000 נוקלאוטידים וכפול פסגות ב-1, 700 עד 1, 800 נוקלאוטידים. השפע של ביניים אלה עולה ככל שהתיול נמשך.
Thiolation מבוצע לאחר מכן עם דגימות נלקח במרווחים של 15 שניות מתחילת תיו-תיוג ואת העיבוד של תעתיק RNA ACT1 מנוטר. כפי שניתן לראות טרום mRNA ו lariats נוצרים גם לאחר רק 15 שניות של תיוג. לאחר כ -45 שניות עד דקה אחת, כמות lariats ו pre-mRNA להגיע שיווי משקל עם כמה שיותר של מינים אלה RNA נוצר על ידי שעתוק כפי מעובדים משם על ידי שזור.
הצעדים הקשים ביותר הם אלה המערבים את חרוזים, כביסה, וחסימה. היזהר לא לאבד את חרוזים, או לתת להם להתייבש. לאחר שתטהר RNA מסונתז חדש, תוכל להשתמש בכל הליך ניתוח RNA מסורתי.
מומלץ להפעיל את ה- RNA על אנליזה ביולוגית או דומה. לאחר מכן, אנו משתמשים בדרך כלל ב- QPCR וב- RNA-Seq כדי לנתח את ה- RNA. שיטה זו הוכיחה אידיאלית לניתוח הקינטיקה של עיבוד RNA.
השלבים המסוכנים ביותר הם אלה באמצעות פנול וכלורופורם בחילוץ RNA. בכל פעם שאתה משתמש בכימיקלים אלה במיכל לא חתוך, לעשות זאת ברדס אדים, וללבוש בגדים מגן מתאימים, חלוק מעבדה, וכפפות. יש לדאוג במיוחד כי אין חרוזים זירקוניה בחוט של צינור כובע בורג, כמו זה יוביל דליפה.
