הבידוד המהיר של הקרופאגים של השורש

ראיות מתעוררות סיבכו את התרומה של מקרופאגים גנגליון שורש הגב להתפתחות כאב נוירופתי ותיקון אקסונאלי בהקשר של פגיעה עצבית. במהירות phenotyping התגובה של מקרופאגים גנגליון שורש הגבי הוא הרצוי לזהות את הגורמים הנוירואימוניים לא ידוע. כאן אנו מדגימים כיצד המעבדה שלנו מבודדת במהירות וביעילות מקרופאגים מחבורת השורש הגבית באמצעות פרוטוקול דיסוציאציה מכני ללא אנזימים.

פרוטוקול זה הוא הרבה פחות זמן רב בהשוואה לפרוטוקולים אנזימטיים סטנדרטיים, ואנחנו כבר השתמשנו בו באופן שגרתי לניתוח מיון התאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות שלנו. לפני תחילת הניסוי, להכין את פתרון העבודה של המדיום שיפוע צפיפות על ידי ערבוב תשעה כרכים של המדיום עם נפח אחד של סידן ומגנזיום חינם 10X HBSS ולשמור אותו על קרח. ודא שהעכבר הוא הרדמה מלאה על ידי חוסר תגובה לצביטת הכפות האחורית.

התחל על ידי הצבת עכבר הרדמה בתוך מכסה המנוע אדים כימי בתאונת סופין עם ארבע כפות מאובטח עם סרט הדבקה. השתמש מדפים כדי להרים את העור מתחת לבית החזה. ואז עם מספריים כירורגיים, לעשות חתך קטן כדי לחשוף את הכבד ואת הסרעפת.

באמצעות אותם מספריים, חותכים את הסרעפת ואת בית החזה. ואז לפתוח את חלל pleural לחשוף את הלב הפועם. הבא עם מספריים איריס, לחתוך במהירות את התוספת פרוזדורים הימנית.

לאחר הדימום הוא ציין, להכניס מחט 30 מד לתוך הקצה האחורי של החדר השמאלי לאט להזריק 10 מיליליטר של PBS 1X מקורר מראש כדי לבלבל את החיה. כדי לבצע כריתת למין הגבית, מניחים את העכבר במצב נוטה. השתמש בגודל 11 אזמל כדי להפוך שני חתכים עמוקים אורך הצדדי החל מאזור בית החזה עד לאזור sacral.

לאחר מכן להסיר את העור חושף את שכבת שריר הגב. לאחר מכן, עם Friedman-Pearson rongeur, לקלף את רקמות החיבור והשרירים עד תהליכי עמוד השדרה lumbosacral ותהליכים רוחביים דו צדדיים נחשפים. ראשית, השתמש ברונגור פרידמן-פירסון כדי לפתוח בזהירות את עמוד השדרה הגבי, ולאחר מכן עבור בין מספריים של פרידמן-פירסון ונויס כדי להסיר את עצמות החוליות, ולחשוף את חוט השדרה עם עצבי עמוד שדרה שלמים מחוברים.

בזהירות לנתח DRG מותני ipsilateral ו contralateral. מניחים אותו למיליליטר אחד של סידן קר כקרח ו- HBSS 1X ללא מגנזיום ב homogenizer רקמת Dounce. הומוגניזציה של רקמת DRG ב homogenizer Dounce עם עלה רופף במשך 20 עד 25 פעמים.

מניחים מסננת תאי ניילון סטרילית של 70 מיקרומטר בצינור חרוט סטרילי של 50 מיליליטר. השתמש 800 microliters של קוד קרח 1X HBSS כדי להרטיב את מסננת התא. השתמש פיפטה כדי לאסוף את ההשעיה רקמה הומוגנית מן homogenizer על מסננת תאים רטובים, ולאסוף אותו לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר.

לשטוף את homogenizer פעמיים עם 800 microliters של קרח קר 1X HBSS, איסוף הנוזל לתוך אותו צינור חרוט 50 מיליליטר כדי להגדיל את התשואה. הוסף 1.5 מיליליטר של קר קרח שמיש בינוני צפיפות איזוטונית לתוך צינור בקבוק פוליסטירן סטרילי חמישה מיליליטר. העבר את הומוגניט התא מצינור חרוט 50 מיליליטר לתוך צינור בקבוקון זה.

ופיגט למעלה ולמטה כדי לערבב היטב. הוסף 500 מיקרוליטרים נוספים של HBSS 1X כדי לאטום את החלק העליון. צנטריפוגה התאים ב 800 פעמים G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס.

בזהירות שאף את העל-טבעי המכיל מילין במדיום מבלי להפריע לכדור התא בתחתית הצינור. הוסיפו 100 מיקרוליטרים של PBS המכילים סרום בקר עוברי של 5% לכדור, והשעו מחדש את תאי ה-DRG. לאחר מכן להוסיף עכבר אלפא CX3CR1 נוגדן APC לתאים דגירה בחושך בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת.

לשטוף את התאים פעם אחת עם חמישה מיליליטר של PBS. צנטריפוגה התאים ב 360 פעמים G במשך שמונה דקות בארבע מעלות צלזיוס. שאף את העל-טבעי, ולאחר מכן השהה מחדש את גלולת התא ב-300 מיקרוליטרים של PBS לצורך ניתוח עובדות.

לאחר זריקות תוך-פרטיות של חומר דימרייזר חלבון מחייב FK AP לעכברי MaFIA כדי לרוקן מקרופאגים, היה אובדן משמעותי של תאים חיוביים GFP ב DRGs של עכברים שטופלו ב- AP בהשוואה לעכברים שטופלו ברכב מבוקר. ניתוח עובדות חשף דלדול מוצלח של אוכלוסייה גבוהה GFP בעכברים שטופלו ב- AP והדגים את האיכות הגבוהה של תאים מבודדים. 4% מכלל התאים המבודדים מה-DRG של בעלי חיים שטופלו ברכב היו מקרופאגים גבוהים של GFP.

לעומת זאת, רק 0.4% מכלל תאי ה-DRG היו מקרופאגים גבוהים של GFP בעכבר שטופל ב- AP. תאי DRG מבודדים מכנית מעכברים מסוג בר היו מוכתמים בנוגדן CX3CR1-APC של עכבר אלפא. 6% מתאים DRG היו מקרופאגים חיוביים CX3CR1.

כאשר הכדאיות התא הוערך עם propidium יודיד, זה גילה כי יותר מ 80% של תאי DRG מבודדים טריים היו קיימא. אם תפוקת התאים הלא מספקת תצוין, ייתכן שיש חשד להומוגניזציה לא מספקת או מוגזמת של רקמת DRG. בנוסף, ניתוח DRG עשוי לדרוש תרגול חוזר למתחילים.

סביר להניח שניתן להרחיב את היישום של הפרוטוקול שלנו כדי לחקור תאים לא עצביים אחרים כגון תאי לווין ותאי T. ייתכן שיהיה צורך במחקרים נוספים כדי לאשר את האפקטיביות של בידוד התא.