Les preuves naissantes ont impliqué la contribution des macrophages dorsales de ganglion de racine au développement neuropathique de douleur et à la réparation axonale dans le contexte des dommages de nerf. Le phénotypage rapide de la réponse des macrophages dorsales de ganglion de racine est désiré pour identifier les facteurs neuroimmuns inconnus. Ici, nous démontrons comment notre laboratoire isole rapidement et efficacement les macrophages des ganglions de racines dorsales à l’aide d’un protocole de dissociation mécanique sans enzymes.
Ce protocole prend beaucoup moins de temps que les protocoles enzymatiques standard, et nous l’avons couramment utilisé pour notre analyse de tri cellulaire activée par fluorescence. Avant de commencer l’expérience, préparez la solution de travail du milieu de gradient de densité en mélangeant neuf volumes du milieu avec un volume de calcium et de magnésium sans 10X HBSS et gardez-le sur la glace. Confirmez que la souris est entièrement anesthésiée par l’absence de réponse au pincement de la patte arrière.
Commencez par placer une souris anesthésiée à l’intérieur d’une hotte de fumée chimique en position supine avec quatre pattes fixées avec du ruban adhésif. Utilisez des forceps pour soulever la peau sous la cage thoracique. Et puis avec des ciseaux chirurgicaux, faire une petite incision pour exposer le foie et le diaphragme.
À l’aide des mêmes ciseaux, couper le diaphragme et la cage thoracique. Et puis ouvrez la cavité pleurale pour exposer le cœur battant. Ensuite, avec des ciseaux d’iris, couper rapidement le bon appendice auriculaire.
Une fois le saignement noté, insérez une aiguille de calibre 30 dans l’extrémité postérieure du ventricule gauche et injectez lentement 10 millilitres de 1X PBS pré-réfrigéré pour imprfuser l’animal. Pour effectuer une laminectomie dorsale, placez la souris en position couchée. Utilisez un scalpel de taille 11 pour faire deux incisions longues latérales latérales profondes à partir de la région thoracique jusqu’à la région sacrée.
Ensuite, retirez la peau exposant la couche musculaire dorsale. Ensuite, avec friedman-Pearson rongeur, décoller les tissus conjonctifs et les muscles jusqu’à ce que les processus de la colonne vertébrale lumbosacrale et les processus transversaux bilatéraux sont exposés. Tout d’abord, utilisez un rongeur Friedman-Pearson pour ouvrir soigneusement la colonne vertébrale dorsale, puis passez d’un rongeur Friedman-Pearson à des ciseaux à ressort Noyes pour enlever les os vertébraux, exposant la moelle épinière avec des nerfs rachidiens intacts attachés.
Disséquer soigneusement le DRG lombaire ipsilateral et contralatéral. Placez-le dans un millilitre de calcium glacé et sans magnésium 1X HBSS dans un homogénéiseur de tissu de Dounce. Homogénéiser le tissu DRG dans l’homogénéiseur Dounce avec un pilon lâche pendant 20 à 25 fois.
Placer une passoire stérile en nylon de 70 micromètres dans un tube conique stérile de 50 millilitres. Utilisez 800 microlitres de code de glace 1X HBSS pour mouiller la passoire cellulaire. Utilisez une pipette pour recueillir la suspension tissulaire homogénéisée de l’homogénéiseur sur la passoire à cellules humides et recueillez-la dans le tube conique de 50 millilitres.
Rincez l’homogénéiseur deux fois avec 800 microlitres de glace froide 1X HBSS, en recueillant le liquide dans le même tube conique de 50 millilitres pour augmenter le rendement. Ajouter 1,5 millilitres de gradient de densité isotonique froid équilibré dans un tube stérile de flacon de polystyrène de cinq millilitres. Transférer l’homogénéité cellulaire du tube conique de 50 millilitres dans ce tube de flacon.
Et pipette de haut en bas pour bien mélanger. Ajouter 500 microlitres supplémentaires de 1X HBSS pour sceller le dessus. Centrifuger les cellules à 800 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.
Aspirez soigneusement le supernatant contenant de la myéline dans le milieu sans déranger la pastille cellulaire au fond du tube. Ajouter 100 microlitres de PBS contenant 5% de sérum bovin fœtal à la pastille, et suspendre à nouveau les cellules DRG. Ajoutez ensuite l’anticorps alpha souris CX3CR1 APC aux cellules et incubez dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant une heure.
Lavez les cellules une fois avec cinq millilitres de PBS. Centrifuger les cellules à 360 fois G pendant huit minutes à quatre degrés Celsius. Aspirer le supernatant, puis re-suspendre la pastille cellulaire dans 300 microlitres de PBS pour l’analyse des faits.
Après des injections intraperitoneal de Dimerizer de protéine FK-liant AP dans les souris de MaFIA pour épuiser des macrophages, il y avait une perte significative des cellules positives de GFP dans les DRGs des souris AP-traitées comparées aux souris traitées par véhicule commandé. L’analyse des faits a révélé un épuisement réussi de la population élevée de GFP chez les souris AP-traitées et a démontré la haute qualité des cellules isolées. 4% du total des cellules isolées du DRG de l’animal traité par véhicule étaient des macrophages élevés GFP.
En revanche seulement 0,4% du total des cellules DRG étaient des macrophages élevés de GFP dans la souris AP-traitée. Les cellules DRG mécaniquement isolées des souris sauvages de type ont été souillées avec l’anticorps de souris alpha CX3CR1-APC. 6% des cellules DRG étaient des macrophages positifs CX3CR1.
Quand la viabilité cellulaire a été évaluée avec l’iodure de propidium, elle a indiqué que plus de 80% des cellules fraîchement isolées de DRG étaient viables. Si le rendement insatisfaisant de cellules est noté, l’homogénéisation insuffisante ou excessive du tissu de DRG peut être suspectée. En outre, la dissection DRG peut nécessiter une pratique répétée pour les débutants.
Il est probable que l’application de notre protocole peut être élargie pour étudier d’autres cellules non neuronales telles que les cellules satellites et les cellules T. D’autres études peuvent être nécessaires pour confirmer l’efficacité de l’isolement cellulaire.
