פרוטוקול זה מאפשר לנו לנטר את דינמיקת האינטראקציה ואת הרזולוציה של צומת הולידיי על ידי דש אנדונוקלאז 1 ברמת המולקולה הבודדת ומערכות אנזימטיות אחרות. ובכן, חלקם יהיו ממוצעים בכל האוכלוסייה המולקולרית או מאבטח את הצעדים המכוניסטיים האישיים הבסיסיים ויש. שיטות מולקולה אחת לספק פרטים אלה על ידי ניטור ההתנהגות בזמן אמת של מולקולות בודדות.
שיטות מולקולה אחת יכולות לזהות ביעילות אינטראקציות ביומולקולריות בטווח פיקו וננומולקולרי עם ספציפיות גבוהה. וזה שימושי עבור פתרונות מעשיים רבים באבחון, ריצוף הגנום, חישה. שיטות אופטיות ומדידה מאולצת של מולקולה אחת מיושמות באופן נרחב בפיזיקה, כימיה וביולוגיה ומוכחות כמספקות תצפיות אציליות שאינן נגישות בשיטות אחרות.
העצה שלי למשתמשים בפעם הראשונה היא לעקוב מקרוב אחר השלבים המפורטים המפורטים המפורטים בפרוטוקול זה. איורים חזותיים של הליך מעשי של פרוטוקול זה יובילו ליישום מוצלח של הטכניקה. כדי להכין את תא זרימת ערוץ יחיד, להתחיל על ידי קידוח שני חורים בקוטר 1.22 מילימטר בחלק האמצעי של שקופית קוורץ 50 על 20 מילימטר עם המרכזים 37 מילימטרים זה מזה ו 6.5 מילימטרים מקצה השקופית.
השתמש חותך אלקטרוני לחתוך ערוץ 41 על ידי 2.25 מילימטר לתוך 50 על 20 מילימטר חתיכת גיליון דבק כפול לקלף את הצד הפלסטיק של כיסוי מגן. ליישר את הקצוות של היצירה עם הקצוות של שקופית קוורץ ולהשתמש זוג פינצטה polytetrafluoroethylene כדי להסיר בעדינות את כל בועות אוויר לכודים. מקלפים את צד הנייר של פיסת דבק ולהרים את היצירה על פני השטח פונקציונלי של להחליק כיסוי.
לאחר מכן, חותכים חתיכה אחת של צינורות פוליאתילן בקוטר פנימי של 1.22 מילימטרים לאורך של 11 ס"מ עבור שקע ופיסת צינורות אחת ל 25 ס"מ עבור השקע. ואז להכניס את הצינורות לתוך החורים שנקדחו בעבר כמו הכניסה צינורות שקע עבור תא הזרימה. ולהשתמש בדבק אפוקסי של חמש דקות כדי לאטום את הקצוות של ממשק החלקת כיסוי הקוורץ בצינורות השקע והמפרצון.
כאשר התא התייבש, להשתמש במזרק 1 מילימטר כדי לשטוף 0.2 מיקרומטר מסונן 0.03 מיליגרם למיליליטר ריכוז avidin ב PBS לתוך התא באמצעות מזרק שני מלא חיץ לבד לשטוף את כל אווילין עודף בסוף שפע. כדי לבצע ניסוי FRET בצבע יחיד, החל תחילה טיפה אחת של שמן טבילה על מטרה פלואורסצנטית השתקפות פנימית פי 100 ולהגדיר את הכפל על שבב של פוטואלקטרונים לרווח מתאים כדי לייעל את האות לרקע ולמנוע רוויה. מניחים בזהירות את תא הזרימה על מחזיק הדגימה, ולהשתמש התאמת מסלול כדי להעלות בהדרגה את המטרה עד השמן נוגע להחליק את המכסה.
הפעל את לייזר 532 ננומטר ולעבור למצב כוונון עדין של המטרה. כוונו את הפליטה ליציאת המצלמה כדי לצפות בתמונה שעל הצג ולהתאים את גובה המטרה עד שהמשטח הפונקציונלי של החלקת הכיסוי יובא לפוקוס ויתבונן בצג. בדוק כי הרקע מפני השטח הפונקציונליים של מחליקי הכיסוי אינו עולה על כמה כתמים לפני זורם ב HJ שכותרתו פלואורסצנטי. כאשר המערכת מוכנה ב 0.2 כדי 0.5 microliters של המצע מדולל של עניין לתוך 120 microliters של חיץ הדמיה עם מערכת ניקוי חמצן לתוך צינור 0.5 מיליליטר ולחבר את השקע של התא האיטי למשאבת מזרק.
הכנס את צינור הכניסה לצינור 1.5 מיליליטר ולהתחיל את משאבת המזרק ב 30 עד 50 microliter לדקה כדי למשוך את הפתרון מהצינור. לעתים קרובות תמונה פני השטח בקצרה עם לייזר ירוק כדי לאשר כיסוי טוב של התא עם 100 כדי 300 חלקיקים של מצע מופץ הומוגנית, במים טובים. אם פני השטח של תא הזרימה מכוסים כראוי, יש לשטוף עוד 120 מיקרוליטרים של מאגר הדמיה במהירות של 30 עד 50 מיקרוליטר לדקה כדי לשטוף כל HJ לא מאוגד ולאפשר לתא הזרימה לשבת במשך 5 דקות כדי לאפשר למערכת חיטוט החמצן לרוקן את החמצן המומס.
הגדר את זמן החשיפה לכ- 60 אלפיות שניה. זמן המחזור יוגדר באופן אוטומטי על-ידי התוכנה בהתבסס על מהירות העברת הנתונים. ציין את מספר המחזורים או המסגרות הרצוי לכ- 400.
הפליטה מהתורם והפליאורופורים המקבלים מפוצלים לערוצי צבע על ידי מכשיר מפצל תמונה. בחר אזור מתאים על פני השטח, התאם את גובה המטרה כדי למקד את התמונה והתקליט ולשמור את הסרט בתבנית tiff של 16 סיביות. ואז לעבור לאזור חדש.
לשטוף את התא עם 120 microliters של מאגר הדמיה בתוספת ריכוזים המצוין של GEN1 בקצב זרימה של 30 microliters לדקה, ריכוז אחד בכל פעם. ברזולוציה של ניסוי מחשוף HJ, להתאים את קצב הזרימה ל 110 microliters לדקה ולהתחיל את ההקלטה 5 עד 10 שניות לפני הכניסה של האנזים לתא הזרימה. ההדמיה להתחיל 5 עד 10 שניות לפני הכניסה של האנזים לתא הזרימה יהיה למקסם את מספר האירועים.
לאחר שכל הריכוזים נבדקו, השתמשו בשקופית קבועה של חרוז פלואורסצנטי כדי למפות את חלקיקי התורם והמקבל זה לזה במכשיר פיצול התמונה. לאחר התקנת חבילת התוכנה המתאימה כדי ליצור מטריצת טרנספורמציה, פתח את סרט השקופיות המוקלט של חרוזים ובחר את המיקומים של חרוזים בודדים בערוצי התורם והמקבל. כאשר המטריצה נוצרה משקופית חרוז קבוע לחץ על טען TFORM ובחר את קובץ מטריצת ההמרה.
בתפריט הנפתח של מסנן הערוצים, לחץ על האפשרות D&A כדי לבחור עבור חלקיקים המסומן הן עם התורם והן עם המקבל. לאחר מכן, הזן plotTimetraceCW כפי שהונחה במדריך כדי ליצור את עקבות הזמן עבור כל מולקולה. כדי לבצע ניסוי ALEX FRET, להקליט סרט המורכב מסגרות רצופות של פליטות תורמים ומקבלים על ידי זרזירות ישירה עם לייזרים ירוקים ואדומים.
פתחו את סרטי ALEX הנרכשים והגדירו את סף הגילוי המתאים בכ-300 לכל אחד מ הפליטות של התורם עקב גירוש תורמים, פליטת מקבלים עקב גירוש תורמים וגירוש מקבל בשל ערוצי העירור הישירים. החל את מסנני הערוץ המתאימים כדי לבחור עבור החלקיקים כי היו גם תורם ומקבל ולקשר 200 כדי 300 חלקיקים בכל אחד משלושת הערוצים. השתמש בקוד MATLAB של plotHistALEX כדי ליצור היסטוגרמות ALEX המתאימות לפסגות שונות בפונקציות ההיסטוגרמה ולהשתמש בתוכנית גרפים וניתוח מתאימה כדי לקבוע את אחוז האזור מתחת לעקומה עבור כל אוכלוסייה.
לאחר מכן השתמש בקוד MATLAB של plotTimetraceALEX כדי ליצור מעקב זמן עבור כל מולקולה המציגה את פליטת התורם על ידי העירור הישיר בפליטת המקבל עקב FRET והגירוש הישיר. זה נציג לסירוגין העירור FRET היסטוגרמה של תווית סמוכה X-0 מראה שתי פסגות התואמות החלפה של isomers בשפע יותר ופחות בשפע. שיעורי isomerization המתקבלים היסטוגרמות זמן להתעכב של isomers עולה בקנה אחד עם אלה שדווחו בעבר.
מולקולה אחת FRET היסטוגרמות של התווית הסמוכה X-0 צומת בריכוזים שונים GEN1 שנרכשו על ידי ALEX, לחשוף שיא אחד המתאים isomer FRET גבוהה חינם שיא אחד המתאים לאוכלוסיית HJ מאוגד לאחר חיסור התרומה של isomer פחות בשפע מן פסגת FRET נמוך. בריכוז GEN1 רווי, היסטוגרמה FRET של X-0 יש רק שיא FRET נמוך אחד המתאים GEN1 מאוגד כל isomer של HJ כפי שחזה המודל. הכריכה של מונומר GEN1 ל- HJ ואחריו היווצרות עמומה יותר היא תכונה ייחודית של ה- HJ האוקריוטי resolvase GEN1 בהשוואה לפתרון פרוקריוטי הקיימים בצורה דימרית בפתרון.
עדות נוספת לכך שמונומר GEN1 קושר ומעוות את ה- HJ היא התבוננות במספר משמעותי של עקבות של חלקיקים לא סלולים עם מצב FRET נמוך ויציב בנוכחות מגנזיום בריכוזי GEN1 נמוכים. עזיבתו בו זמנית של התורם והמקבל לאחר מצב FRET נמוך ויציב עקבות של X-0 נפתר המתרחשת ללא הופעתה של ביניים עולה כי החלטה מלאה מתרחשת בתוך החיים של מתחם GEN1 HJ. שים לב כי הרקע מפני השטח זכוכית פונקציונלי לא יעלה על כמה כתמים, כי חלקיקים מופצים באופן שווה חיוניים להשגת תוצאות טובות.
תמיד להשתמש בציוד מגן אישי מכסה המנוע אדים בעת הכנת תמונת עריכה בסידרה. הקפד להרכיב משקפי מגן ספציפי אורכי הגל בעת עבודה עם לייזרים. שיטות אחרות כגון cryo ap, תהודה מגנטית גרעינית, יכול לספק פרטים מבניים ברמה האטומית.
מידע זה הוא חלק בלתי נפרד מהעיצוב והפרשנות של ניסויי FRET במולקולה אחת. מולקולה אחת FRET לפתוח תצוגות חדשות בתחום של שכפול DNA וכתוצאה מכך הבנה עמוקה יותר של מנגנוני הפעולות helicases ו nucleases.
