מחקר זה מומן בחלקו על ידי תכנית המחקר העירונית של NIH, המכון הלאומי להזדקנות (Z01 AG000746-08) וקרן מחקר אנמיה Fanconi.

1. הכנת Dig-TMP <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 50 מ&quot;ג (0.18 mmoles) של 4&#39;-chloromethyl-4,5&#39; , 8-trimethylpsoralen ו 590 מ&quot;ג (2.7 mmoles) של 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-אמין ב סבב 25 מ&quot;ל יבש בקבוק -bottom תחת חנקן. להוסיף 10 מ&quot;ל טולואן ריפלוקס עבור 12 h. הסר ממס ב מאייד סיבובי בלחץ מופחת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לטהר את השאריות ידי כרומטוגרפיה בעמודה פלאש מעל ג&#39;ל סיליקה. Elute הטור עם כלורופורם, מתנול, פתרון אמוניה 28% (9: 1: 0.5). לאדות את הממס ב מאייד סיבובי בלחץ מופחת, וכן לשחזר את טהור 4 &#39;- [N- (13-אמינו-4,7,10-trioxatrideca)] aminomethyl-4,5&#39;, 8-trimethylpsoralen כמו צהוב חיוור צמיג נוזל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 5.5 מ&quot;ג (0.012 mmoles) של 4 &#39;- [N- (13-אמינו-4,7,10-trioxatrideca)] aminomethyl-4,5&#39;, 8-trimethylpsoralen עם 5 מ&quot;ג (0.008 mmoles) של אסתר NHS digoxigenin ב בקבוק מסביב לתחתית יבש תחת חנקן. להוסיף 0.5 לפוראמיד דימתיל נטול מ&quot;ל (DMF) עלד 3.4 μL של trimethylamine ומערבבים על 50 מעלות צלזיוס למשך 18 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר ממס ב מאייד סיבובי בלחץ מופחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את שאריות בסכום מינימום של dichloromethane. החל את פתרון 2 נקודות μL אופקית לאורך החלק התחתון של צלחת שכבה דקה ההכנה עם ג&#39;ל סיליקה כשלב נייח. הפעל את TLC ההכנה כלורופורם: מתנול: אמוניום הידרוקסיד 28% (8: 1: 0.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסוות את הצלחת להוציא את הקצוות האנכיים ולזהות את הלהקה של המוצר עם מנורה ננומטר 254 UV באורך גל קצר. גרד את המוצר מהצלחת עם מרית לבודד את המוצר הטהור באמצעות כלורופורם: מתנול: אמוניום הידרוקסיד 28% (8: 1: 0.1) תערובת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סר ממס ב מאייד סיבובי בלחץ מופחת. ממיסים את כדורי שיורית 1 מ&quot;ל של 50% EtOH: H 2 O, לוותר לתוך 50 aliquots μL ב 1.5 מ&quot;ל צינורות (~ 20 aliquots) ויבש המאייד צנטריפוגלי עד שכל הממס הוא התאדה (~ 3 h). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">Redissolve כל aliquot ב 200 μL של 50% EtOH: H 2 O ויבש שוב המאייד צנטריפוגלי. ממיסים כל aliquot שוב 200 μL של 50% EtOH: H 2 O, יבש בתוך כדורי המאייד וחנות צנטריפוגלי ב -20 ° C עבור אחסון לטווח ארוך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשימוש, לפזר את הגלולה ב 50 μL של EtOH 50%: H 2 O. כן 1: דילול 100 של Dig-TMP מומס H 2 O ולמדוד OD ב 250 ננומטר. מקדם הכחדה של Dig-TMP הוא 25,000. הפתרון הוא יציב במשך חודש על אותם אם הם נמצאים -20 ° C. בדוק את הריכוז ידי מדידת OD ב 250 ננומטר לפני כל שימוש. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב ריכוז המניות: ABS x 100 x10 6 / 25,000 = ריכוז (ב מיקרומטר). בדרך כלל פתרון המניות הוא כ 3 מ&quot;מ. חשוב להיות בטווח זה על מנת למזער את היקף EtOH מתווסף בינוני. </li></ol></li></ol> 2. לייזר מותאם למקום Dig-TMP ICLs <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלוקליזציה לייזר rform עם מיקרוסקופ confocal עם לייזר חנקן SRS (337 ננומטר) נשאבים באמצעות תא צבע פולטות קו של 365 ננומטר ו ירי 3 פולסים NS ב 10 הרץ, עם כוח של 0.7 NW. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך סימן אנכי בצד של זכוכית 35 מ&quot;מ תחתי צלחת תרבית תאים עם עט סימון. גרד צלב במרכז הזכוכית על פני השטח בתרבות עם עט יהלום כזה פס שחור בצד של המנה הוא בראש זרוע אחת של הצלב. הצלב הוא מסומן על פני שטח הצמיחה של הזכוכית כך והתאים יהיו באותו מישור המוקד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הצלחת לאחר סימון עם שטיפה של 70% EtOH. ניקוי לפני ציפוי התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאי פלייט (זני מעבדה סטנדרטיים כגון הלה או U2OS) ב cross המסומנים מנות תרבות אחת או ימים לפני. תא צריך להיות חלוקה פעילה 50-70% ומחוברים ביום הניסוי. דגירה 24 שעות עם 1 מיקרומטר 5-כלורו-2-deoxyuridine (CldU) ל- DNA תווית באופן אחיד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לְהוֹסִיףDig-TMP ב EtOH 50%: H 2 O ל תרבית תאים בינוניים לריכוז סופי של 20 מיקרומטר. תביא את המדיום כדי 37 מעלות צלזיוס. שינוי המדיום מעל התאים ומכניסים אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2) עבור 30 דקות כדי לאפשר Dig-TMP כדי לאזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד התאים דוגרים, להקים את x / y של שדה ראייה שבה הליזר פעיל. בצע את הליך הכיול של היצרן שבו הלייזר מכוון על ידי תוכנה כדי לחרוט שקופית זכוכית מראות לאורך קו אופקי אלכסוני. שתי השורות להגדיר את גבולות התחום שבו הלייזר יכול להכות מטרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את הצלחת בתא הסביבתי, ב 37 מעלות צלזיוס עם נשלט CO 2 ולחות, על במת מיקרוסקופ ולהתמקד במטרת שמן 60X על ההצטלבות של הצלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כוונו את קרן לייזר 365 ננומטר ל ROI, הוקמה על ידי החוקר עם כלי הצורה בתוכנה, כדי ליצור פס של 3 &amp;# 181; MX 0.6 מיקרומטר. המתווה של ROI מושמת על ידי סמן גרעינים של תאים הממוקמים בסביבה הקרובה של ההצטלבות של הצלב. התאם את המטוס z מוקד למקד את מידוויי לייזר דרך הגרעין. השתמש בלייזר בטווח של 350-370 ננומטר. 405 nm לייזרים לא יכול לגרום crosslinks 19. הערה: אנו לאתר את ההחזר על ההשקעה באזורים nucleoplasmic מחוץ nucleoli, אשר ניתן להבחין בין nucleoplasm בניגוד התערבות ההפרש (DIC) הדמיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את המיקוד ואת הפעילות של הלייזר על ידי הגדלת ההספק לרמה מספיקה כדי למחוק תא (תא תחשיך ואז נעלמים). זהו אבחון חשוב עבור נתיב האור הפרעה עבור לייזר באמצעות מיקרוסקופ ואז דרך coverslip ו לתוך התאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפחת את הגדרת הכוח מספיק כדי להפעיל את psoralen ואת DDR המושרה כיל (זו צריכה להיקבע באופן אמפירי לכל לייזר / מיקרופוןroscope שילוב). השתמש עוצמת הלייזר הגדרת (1.7% כאן) כי אינו להפעיל את DDR בהעדר psoralen (פיקוח על ידי היווצרות של γ-H2AX). הערה: זוהי קביעה חשובה ואת ההגדרות עשויות לדרוש התאמה אם מקור הליזר או רכיב בנתיב האור משתנה. בצע את ההצטברות של GFP מתויגת חלבוני תיקון כגון XPC או FAN1, אשר שניהם גייסו במהירות (תוך שניות) אל פסי psoralen ליזר, אבל לא לרועי חשופי הליזר לבד. חלבונים מסוימים של DDR להופיע בתוך שניות, תוך דקות אחדות עשויות להידרש ואחרים. יש צורך לבצע קביעות כמובן זמן עבור כל חלבון של עניין. נציין כי בתאים שלא נחשפו לייזר אין פסים של חלבונים להגיב. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחרי הכל מתאים בשדה היה ממוקד מהלך הצליחו לתחום חדש, להישאר קרוב לצומת של הצלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניסויים שנועדו determine חלוקת מרחקי נגע שאר לחשוף תאים אל הליזר ב 20-25 שדות (4-5 תאים / שדה) סביב הצומת. על מנת לנתח דפוסים שכפולים בסביבה של ICLs המקומי לדגור תאים עם 10 מיקרומטר 5-Iodo-2-deoxyuridine (IdU) לאחר ירי ליזר. הערה: זמן דגירה עם IdU היא שרירותית. השתמשנו קצר ככל 20 דקות וכל עוד 60 דק &#39;(ראה להלן). פולסים ארוכים יותר (כמה שעות) לעתים לגרום שטחים שכפולים מרובים התגבשו, ובכך לאבד את הזדמנות תמונת התקדמות מזלגות חד. בניסויים מסוימים CES מסומנים עם CldU עבור 24 שעות כדי אחיד DNA התווית לפני חשיפה לחפור-TMP ואחריו תיוג הדופק של שטחים שכפול. </li></ol> קציר 3. תאים ומתיחה של סיבי DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחת מן הבמה, להסיר את המדיום, ולשטוף עם בופר פוספט (PBS). הסר את פתרון PBS. מניחים ירידה 10 μL של טריפסין מסחרי/ פתרון EDTA על ההצטלבות של הצלב באמצע משטח הזכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה של 3-4 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ולאחר מכן לצייר את הפתרון טריפסין עם תאים מנותקים לתוך קצה pipet. אין צורך לנטרל את טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את טיפת טריפסין / EDTA עם תאים בקצה אחד של המיקרוסקופ שקופית זכוכית silanized. Lyse את התאים לשחרר את ה- DNA על ידי תוספת של 10 μL של פתרון 0.5% SDS דגירה במשך 3-4 דקות ב RT ערבוב בעדינות עם קצה pipet, המאפשר בפריפריה של הבריכה לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטה את השקופית 20º ולאפשר את הנוזל לרוץ עד הסוף. סיבי DNA מורחבים / נמתחו על ידי הכוחות הידרודינמית של הנוזל זורם. תנו אוויר יבש מגלשות (~ 10 דקות) ולתקן ב 3: 1 מתנול / חומצה אצטית עבור 10 דקות. הסר את השקופיות מפתרון לתקן ואוויר יבש שוב. בשלב זה הם יכולים להיות מאוחסנים ללא הגבלת זמן ב 70% EtOH ב -20 מעלות צלזיוס. על הסרה מן EtOH 70% ולאפשר לאוויר יבש לפני neצעד XT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף שקופיות PBS, ולאחר מכן לפגל ב 2.5 M HCl עבור 1 ש &#39;ב RT. טיפול זה depurinates DNA שהופך את nucleobases הלוגנים משולב נגישה נוגדנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל שקופיות 0.4 M Tris-HCl, 7.4 pH. פעמיים לשטוף ב PBS / 0.5% Tween-20 (PBST) במשך 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלוק מחליק עם 5% שור סרום אלבומין (BSA) ו 10% בסרום עיזים ב PBS. מכסים את השקופיות בעדינות עם parafilm להפיץ את הפתרון חוסם באופן שווה על פני השקופית ועל דגירה של 1 ש &#39;ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 100 μL של 1: 200 דילול פתרון חסימה של האנטי-bromodeoxyuridine חולדה (במיוחד מזהה CldU) נוגדן ראשוני לכל שקופית. מכסים את השקופיות בעדינות עם parafilm להפיץ את דילול באופן שווה על פני השקופית ועל דגירה בתא humidified עבור 1 ש &#39;ב RT. הסר את parafilm לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBST עבור 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 100 μL של מדולל (1: 100) עז נגד עכברוש אלקסה פלואוריד 647 בחסימת פתרון לכל שקופית. תכסה אתמחליק בעדינות עם parafilm ו דגירה של 45 דקות ב RT. לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBST עבור 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 100 μL של דילול (01:40) עכבר bromodeoxyuridine אנטי (מזהה ldU ו CldU זה סגוליות כפול מצריך חסימת CldU ידי BrdU אנטי עכברוש הדגירה לפני.) נוגדן ראשוני ארנב אנטי DIG נוגדן (1: 200 ) בחסימת פתרון לכל שקופית. מכסים את השקופיות בעדינות עם parafilm ו דגירה בתא humidified עבור 1 ש &#39;ב RT. לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBST עבור 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet 100 μL של מדולל (1: 100) עז נגד העכבר Alexa פלואוריד 488 andc (1: 5000) בדיקה נגד ארנב עיזים (למשל, Qdot 655) בחסימת פתרון לכל שקופית. מכסים את השקופיות בעדינות עם parafilm ו דגירה של 45 דקות ב RT. לשטוף את השקופיות שלוש פעמים PBST עבור 5 דקות כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסנני PBST העודף על גבי מגבת נייר. להוסיף 50 μL של antifade הרכבה בינונית על כל שקופית ומכסים coverslip. תמונה או חנותלא יותר מ 48 שעות ב -20 מעלות צלזיוס. </li></ol> 4. הדמיה סיבים ידי הקרינה מיקרוסקופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע רכישת התמונה דרך אובייקטיבית 63X על מיקרוסקופ הפוכה עם גלגל מסנן ממונע המצורפת במלואה עם FITC, Cy5 ו- Q Dot 655 זיהוי. מסנן העירור הוא 425 ננומטר, ואת מסנן הפליטה הוא 655 ננומטר עם 20 ננומטר מרוכזים בשיא הפליטה 20. </li></ol>

<ol>
	<li>Lindahl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Intrinsic+Fragility+of+DNA+(Nobel+Lecture).">The Intrinsic Fragility of DNA (Nobel Lecture).</a> Angew. Chem. Int. Ed Engl. 55 (30), 8528-8534 (2016).</li><li>Sirbu, B. M., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+response:+three+levels+of+DNA+repair+regulation.">DNA damage response: three levels of DNA repair regulation.</a> Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a01272 (2013).</li><li>Berkovich, E., Monnat, R. J., Kastan, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+protein+dynamics+and+DNA+repair+following+generation+of+DNA+double-strand+breaks+at+defined+genomic+sites.">Assessment of protein dynamics and DNA repair following generation of DNA double-strand breaks at defined genomic sites.</a> Nat. Protoc. 3 (5), 915-922 (2008).</li><li>Rogakou, E. P., Boon, C., Redon, C., Bonner, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Megabase+chromatin+domains+involved+in+DNA+double-strand+breaks+in+vivo.">Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo.</a> J. Cell Biol. 146, 905-916 (1999).</li><li>Lan, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+analysis+of+repair+processes+for+oxidative+DNA+damage+in+mammalian+cells.">In situ analysis of repair processes for oxidative DNA damage in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 13738-13743 (2004).</li><li>Reynolds, P., Botchway, S. W., Parker, A. W., O'Neill, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatiotemporal+dynamics+of+DNA+repair+proteins+following+laser+microbeam+induced+DNA+damage+-+when+is+a+DSB+not+a+DSB?.">Spatiotemporal dynamics of DNA repair proteins following laser microbeam induced DNA damage - when is a DSB not a DSB?.</a> Mutat. Res. 756, 14-20 (2013).</li><li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+DNA+double-strand+breaks:+production,+fidelity+of+repair,+and+induction+of+cancer.">Endogenous DNA double-strand breaks: production, fidelity of repair, and induction of cancer.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 12871-12876 (2003).</li><li>Vilenchik, M. M., Knudson, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+dose-rate+effects,+endogenous+DNA+damage,+and+signaling+resonance.">Radiation dose-rate effects, endogenous DNA damage, and signaling resonance.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 17874-17879 (2006).</li><li>Aguilera, A., Garcia-Muse, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Causes+of+genome+instability.">Causes of genome instability.</a> Annu. Rev. Genet. 47, 1-32 (2013).</li><li>Swenberg, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endogenous+versus+exogenous+DNA+adducts:+their+role+in+carcinogenesis,+epidemiology,+and+risk+assessment.">Endogenous versus exogenous DNA adducts: their role in carcinogenesis, epidemiology, and risk assessment.</a> Toxicol. Sci. 120 (1), S130-S145 (2011).</li><li>Eichman, B. F., Mooers, B. H., Alberti, M., Hearst, J. E., Ho, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structures+of+psoralen+cross-linked+DNAs:+drug-dependent+formation+of+holliday+junctions.">The crystal structures of psoralen cross-linked DNAs: drug-dependent formation of holliday junctions.</a> J. Mol. Biol. 308, 15-26 (2001).</li><li>Lai, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+DNA+interstrand+cross-links+and+monoadducts+formed+in+human+cells+induced+by+psoralens+and+UVA+irradiation.">Quantitative analysis of DNA interstrand cross-links and monoadducts formed in human cells induced by psoralens and UVA irradiation.</a> Anal. Chem. 80, 8790-8798 (2008).</li><li>Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Indig, F. E., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Psoralen+conjugates+for+visualization+of+genomic+interstrand+cross-links+localized+by+laser+photoactivation.">Psoralen conjugates for visualization of genomic interstrand cross-links localized by laser photoactivation.</a> Bioconjug. Chem. 18, 431-437 (2007).</li><li>Muniandy, P. A., Thapa, D., Thazhathveetil, A. K., Liu, S. T., Seidman, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+laser-localized+DNA+interstrand+cross-links+in+G1+phase+mammalian+cells.">Repair of laser-localized DNA interstrand cross-links in G1 phase mammalian cells.</a> J Biol. Chem. 284 (41), 27908-27917 (2009).</li><li>Nowsheen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+oxidatively+induced+clustered+DNA+lesions+in+human+tumor+tissues.">Accumulation of oxidatively induced clustered DNA lesions in human tumor tissues.</a> Mutat. Res. 674, 131-136 (2009).</li><li>Meyer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clustered+DNA+damage+induces+pan-nuclear+H2AX+phosphorylation+mediated+by+ATM+and+DNA-PK.">Clustered DNA damage induces pan-nuclear H2AX phosphorylation mediated by ATM and DNA-PK.</a> Nucl Acids Res. 41, 6109-6118 (2013).</li><li>Schwab, R. A., Niedzwiedz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+DNA+replication+in+the+vertebrate+model+system+DT40+using+the+DNA+fiber+technique.">Visualization of DNA replication in the vertebrate model system DT40 using the DNA fiber technique.</a> J Vis. Exp. (56), e3255 (2011).</li><li>Kad, N. M., Wang, H., Kennedy, G. G., Warshaw, D. M., Van, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collaborative+dynamic+DNA+scanning+by+nucleotide+excision+repair+proteins+investigated+by+single-+molecule+imaging+of+quantum-dot-labeled+proteins.">Collaborative dynamic DNA scanning by nucleotide excision repair proteins investigated by single- molecule imaging of quantum-dot-labeled proteins.</a> Mol. Cell. 37 (5), 702-713 (2010).</li><li>Spielmann, H. P., Sastry, S. S., Hearst, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+large-scale+synthesis+of+psoralen+furan-side+monoadducts+and+diadducts.">Methods for the large-scale synthesis of psoralen furan-side monoadducts and diadducts.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89 (10), 4514-4518 (1992).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+translocase+FANCM/MHF+promotes+replication+traverse+of+DNA+interstrand+crosslinks.">The DNA translocase FANCM/MHF promotes replication traverse of DNA interstrand crosslinks.</a> Mol. Cell. 52, 434-446 (2013).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+Molecule+Analysis+of+Laser+Localized+Interstrand+Crosslinks.">Single Molecule Analysis of Laser Localized Interstrand Crosslinks.</a> Front Genet. 7, 84 (2016).</li><li>Ciccia, A., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA+damage+response:+making+it+safe+to+play+with+knives.">The DNA damage response: making it safe to play with knives.</a> Mol. Cell. 40, 179-204 (2010).</li><li>Mori, T., Matsunaga, T., Hirose, T., Nikaido, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishment+of+a+monoclonal+antibody+recognizing+ultraviolet+light-induced+(6-4)+photoproducts.">Establishment of a monoclonal antibody recognizing ultraviolet light-induced (6-4) photoproducts.</a> Mutat. Res. 194, 263-270 (1988).</li><li>Poirier, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisera+specific+for+carcinogen-DNA+adducts+and+carcinogen-modified+DNA:+applications+for+detection+of+xenobiotics+in+biological+samples.">Antisera specific for carcinogen-DNA adducts and carcinogen-modified DNA: applications for detection of xenobiotics in biological samples.</a> Mutat. Res. 288, 31-38 (1993).</li><li>Henderson, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+G-quadruplex+DNA+in+mammalian+cells.">Detection of G-quadruplex DNA in mammalian cells.</a> Nucleic Acids Res. 42, 860-869 (2014).</li></ol>

החוקרים אין לחשוף.

הטכנולוגיה לוקליזציה לייזר מחייב שימוש בתאי חסיד עם גרעינים הנראים מיקרוסקופ שדה בהיר. ניסינו לצרף תאי nonadherent, כגון לימפוציטים עיקרי, או תאים בתרבית חסיד רופף כמו AD293, אל משטח הזכוכית עם הכנות דבקות תא כגון polylysine או קולגן, או תערובות מורכבות יותר. למרות טיפולים אלה עשויים להיקשר לתאים פני השטח, אנו מוצאים כי הם נשארים בדרך כלל מעוגלים מה שהופך אותו מאוד קשה להתמקד לתוך הגרעינים. יתר על כן, התאים לעיתים קרובות אינם מצליחים לשרוד את שטיפת הראשונית לאחר הסרת מדיום הגידול. עם זאת, בתוך דרישת תאים חסידים, השתמשנו בהצלחה במגוון רחב של שורות תאים סטנדרטיות, כמו גם תאים ראשוניים ללימודים אלה. כדאי לבדוק תאים עבור זיהום mycoplasma. אנו מוצאים כי תגובות תא משתנות על ידי זיהומים אלה. במישור המוקד של הלייזר הוא חשוב. המטרה היאלמקם את ICLs בתוך הגרעין. גבוה מדי ואת photoactivation יהיה מעל הגרעין; נמוך מדי וזה יהיה על הזכוכית. אנו מוצאים אותו שימושי כדי לחדד את הפוקוס של התמונה DIC בצומת של הציטופלסמה לבין הגרעין. מבחני הסיבים אינם קשים, אך דורשים מעט תרגול לפני שדות לפירוש הם התאוששו. חשוב ליישם את הטכניקה הזו כמו שצריך. מספר התאים התאוששו מן ניסויי הליזר הוא נמוך כל דגימה משמשת בשלמותו בשקופית אחת. כתוצאה מכך הוא חיוני על מנת למקסם את התשואה בכל ניסוי, כמו דגימות לא ניתן לפצל, עם aliquots הציל לניתוח מאוחר יותר. עם זאת, מאות אירועים ניתן לשחזר ממדגם יחיד. שני מאפיינים של התהליך הם בעלי חשיבות מרכזית. האחד הוא קצב זרימת lysate התא במורד המגלשה. אם מהר מדי, הרבה של ה- DNA יהיה לברוח המגלשה. איכות שקופיות הזכוכית היא גם קריטית. מדי פעם אנו Receאייב הרבה כי הם לא יעילים. כתוצאה מכך כל הרבה חדשים חייבים להיבדק לפני השימוש. כפי שנכון עבור כל מניפולציות מעבדת האמינות של חומרים נגד נוגדנים מסחריים, נקודות immunoquantum, וכו &#39;, היא תמיד דאגה. אלה אינם תמיד יציבים וכישלון הניסיון בדרך כלל לייחס לבעיות עם אחד או מגיב אחר. נקודות immunoquantum בעייתיות במיוחד ויותר מ הרבה אחד ייתכן שיהיה צורך להיבדק על מנת לזהות אחד כי הוא מקובל. המון יעיל מסומנים על ידי אותות רקע גבוהים. אלה אינם משויכים עם סיבים יראו על אזורים של השקופית שאין להם DNA. השימוש בלייזר להציג נזק לדנ&quot;א המקומי הפך פופולרי למדי שכן הוא הוצג על ידי קבוצת בונר 4. באותם וניסויים העוקבים ביותר הגדרות כוח הליזר נקבעות כדי לגרום DDR ישירות. השתמשנו כוח הגדרת suc מספיק נמוךh כי הפעלת DDR תלויה בשני לייזר ו psoralen. כפי שפורט לעיל, ההפרדה בין adducts psoralen טוען שאנחנו מסתכלים בתגובה לאירועים פרטיים. בעוד מספר ICLs כי נוצרים על ידי סוכני crosslinking אנדוגניים אינו ידוע, נציין כי הלוקליזציה של adducts psoralen שלא הורגת תאים, כפי שהם מסוגלים להסיר את adducts psoralen בתוך 6-8 שעות (נתונים שלא פורסמו) ו נוכחים ובריאים כעבור 24 שעות. לכן גישה זו היא הרבה פחות רעיל לתאים מ פרוטוקולים הדורשים חשיפה לחומרים כי להציג נזק לדנ&quot;א ברחבי גרעין המיטוכונדריה. שילוב הליזר / psoralen להציג מבנה מעוות סליל חשמלי שיפעיל את DDR. בהקשר זה את התוצאות שהתקבלו בגישה זו חלות מגוון של נגעים מעוותים Helix, בהתחשב באופי המדורג של DDR, בעקבות הפעלת הכספומט / DNAPK / ATR קינאזות 22.בהקשר זה את גישת סיבי DNA המתוארת כאן יכולה להתארך לכל מבנה ה- DNA כי ניתן לאתר באמצעות חיסוני או כימי או ביוכימיים שניתן להציג על ידי קרינה. אלו יכולים לכלול UV photoproducts 23, alkylators מגושם 24, quadruplexes G 25, ונגעים חמצוני 5.

DNA נמצאת תחת מתקפה מתמדת מצד סוכנים חיצוניים כגון קרינה, אור אולטרה סגול, רעלים סביבתיים, תוצרי בעירה, וכו &#39;בנוסף, הוא תקף גם על ידי מינים רדיקליים אנדוגניים מיוצרים על ידי מטבוליזם חמצונים. לכל אלה פוטנציאל כימי או פיזי לשבש את תקינות DNA 1. הפרעות בגנום יכול להפעיל את תגובת נזק לדנ&quot;א (DDR), גיוס ומתפזרות שינוי פוסט translational עם מאות, אם לא אלפי, של חלבונים מיקרו-רנ&quot;א מעורב תיקון הנגע, הסדרת מחזור התא, אפופטוזיס, הזדקנות, והמסלולים דלקתיות 2. רוב המידע שלנו לגבי DDR מגיע ממחקרים עם DSBs. זהו במידה רבה בשל הזמינות של טכנולוגיות מציגים הפסקות, כוללים רצף הפסקות ספציפיות, ב DNA הגנומי בתאים חיים 3. בנוסף, propensity של הפסקות לגרום מוקדים של חלבונים DDR, אשר יכול להיות מוצג על ידי immunofluorescence, עזר לי מאוד לזיהוי קינטיקה והדרישות של חלבונים להגיב. אחת מהטכנולוגיות מפתח ללימוד DDR הוצג על ידי בונר ועמיתיו, שהשתמשו קרן לייזר לכוון פס של DSBs בתוך &quot;אזור של אינטרס&quot; (ROI) האצור בגרעיני התאים החיים 4. למעשה, הם יצרו מוקד ארוך, שבו חלבונים של DDR יכולים להיות מזוהים על ידי immunofluorescence. הדבר הומחש על ידי ההפגנה שלהם של הפס החזק של H2AX היסטון פוספורילציה (γ-H2AX) בתאים שנחשפו הליזר. מאז, הגישה לייזר כבר המועסקים מחקרים רבים של DDR המושרה על ידי DSBs. למרות חזק ופופולרי, ואת המקור של תמונות immunofluorescence דרמטיות, יש לציין כי ברוב הניסויים עוצמי הליזר מותאם על מנת לייצר תוצאות נצפות, בלי דאגת זהות נגע,צפיפות, או ריווח. ואכן, זה יכול להיות קשה לבצע אומדנים אלה. לכן הם התעלמו במידה רבה, למרות ריבוי הנגעים הציגו לתוך ה- DNA על ידי לייזרים 5. זה תורם סתירות רבות בספרות 6. בניגוד DSBs, השינויים הכימיים ביותר של דנ&quot;א לא לעורר היווצרות מוקדים הנפרדים של חלבוני DDR. זה חשוב לאור ההבנה הנוכחית שלנו של תדרי נגע. ההערכה היא כי תאי האדם בתרבות נגרמו רבים ככל 50 DSBs לכל מחזור התא, נוצר ברובו במהלך S שלב 7, 8, 9. פחות נוצרים בתאים שאינם מתרבים. זאת בניגוד מספר הפסדים nucleobase או אירועים שינוי, אשר נמצאים עשרות אלפי לכל תא / יום 1, 10. לפיכך, אנו יודעים הכימהרפובליקה מושרה על ידי אירועים נדירים יחסית, והרבה פחות על אלה המושרים על ידי נגעים מעוותי סליל, אשר במצטבר שכיח הרבה יותר. על מנת לענות על שאלות לגבי תגובת התאים קוולנטיים שינויים של DNA גנומי, רצינו לעבוד עם adduct DNA מעוותת Helix שיש פעילות אינדוקציה DDR הטבועה. יתר על כן, כדי להקל על עיצוב ניסיוני ופרשנות היינו מעוניינים מבנה המבוא אשר יכול להיות נשלט ביחס לזמן והיה מקובל ויזואליזציה. בהתאם לכך, פיתחנו אסטרטגיה המבוססת על psoralen. Psoralens גם מאופיינים intercalators DNA photoactive העדפת 5&#39; ת&quot;א: באתרים. בניגוד סוכנים crosslinking אחרים כגון חרדל חנקן ו mitomycin C (MMC) הם אינם DNA תגובתי אלא חשופים גל ארוך UV (UVA) אור. מולקולות intercalated מגיבות עם בסיסי תימין על גדילי היפך לייצר crosslinks interstrand מעוותת סליל (ICLs11). עם psoralen trimethyl השתמש בניסויים שלנו רוב המוצרים הם ICLs, מעטים יחסית monoadducts נוצר (פחות מ 10%) 12, ו crosslinks intrastrand בין בסיסים הסמוכים על גדיל אחד לא נוצר. מכיוון שהם אבני עוצמה כדי שכפול שעתוק, psoralen וסוכני crosslinking אחרים, כמו ציס-פלטינה ו- MMC, משמשים בדרך כלל כימותרפיה. לפיכך psoralen לאפשר מחקרים שלאחר הפעלת DDR ידי מבנה מעוות Helix, וגם ספקו תובנה התגובה התאית למתחם עם חשיבות קלינית. אנחנו מסונתז ריאגנט שבו psoralen trimethyl היה מקושר digoxigenin (DIG) חברה sterol הצמח לא נמצא בתאי יונקים שימוש תכוף כמו immunotag. הדרישה עבור photoactivation מתיר לוקליזציה ידי אור לייזר (365 ננומטר) של ICLs psoralen ב ROI מוגדר בגרעין בתאים חיים. אלה יכולים להיות מוצגים על ידי IMMunofluorescence נגד תג Dig. תיקון דנ&quot;א וחלבונים DDR הופיעו פסים של לייזר מקומי 13 ICLs, 14. מהרפובליקה מופעל על ידי בעוצמות לייזר גבוהה משמש לייצור DSBs יכול להיות בגלל הנזק מבודד או מקובצים 15, 16. כתוצאה מכך, את הרלוונטיות של תוצאות מניסויים אלה המתרחשים נגעים טבעיים, נוכח הרבה ריכוז נמוך, אינו ברור. כדי לענות על שאלות דומות לגבי תדירות adduct psoralen והריווח ב DNA, לקחנו את היתרונות של טכנולוגיית סיבים DNA 17 ונקודות immunoquantum. נקודות קוונטיות הן הרבה יותר בהירות צבעי ניאון ואינם מולבנות על ידי חשיפה לאור. לכן הם משמשים לעתים קרובות עבור הדמית מולקולה בודדת 18, בקשה אשר צבעי ניאון בהירים מספיק. ניתן למתוח סיבי DNA בודדים על gמגלשות נַעֲרָה ויכולים להיות מוצגות על ידי immunofluorescence נגד אנלוגים nucleoside שולבו במהלך incubations לפני תא קציר. התייחסנו תאים עם Dig-psoralen וחשף את ההחזר על ההשקעה הקרנה מיקרו לייזר. סיבים הוכנו מן התאים adducts Dig-psoralen הפרט יכול להיות דמיינו עם הנקודות immunoquantum. חשיפת תאי nucleoside אנלוגים לזמנים קצרים יחסית (20-60 דקות) מאפשרת את התצוגה של שטחים שכפולים בסביבה של ICLs הליזר מקומי.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Digoxigenin NHS ester</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>11333054001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloro-psoralen</td>
			<td>Berry and Associates</td>
			<td>PS 5000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>diaminoglycol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>369519</td>
			<td>4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chloroform</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>423550040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A4524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ammonium solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>5002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TLC plates</td>
			<td>Analtech, Inc.</td>
			<td>P02511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flass glass column 24/40, 100ml</td>
			<td>Chemglass Life Sciences</td>
			<td>CG-1196-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder</td>
			<td>Perkin Elmer</td>
			<td></td>
			<td>With Volocity Software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropoint Galvo&#160;</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td></td>
			<td>with a Nitrogen pulsed laser&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>dye cell</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>MP-2250-2-365</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>365 dye</td>
			<td>Andor Technologies</td>
			<td>MP-27-365-DYE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IdU&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>17125</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10mm glass diameter, uncoated</td>
			<td>Matek</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>New Comer Supply</td>
			<td>Part # 5070</td>
			<td>New Silane Slides</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mouse anti BrdU antibody (IdU)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>347580</td>
			<td>1 in 40</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat anti BrdU Antibody (CldU)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab6326</td>
			<td>1 in 200&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit anti Dig antibody</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>710019</td>
			<td>1 in 200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>Q-11421MP</td>
			<td>1 in 5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF647- goat anti Rat IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>112-605-167</td>
			<td>1 in 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AF488-goat anti mouse IgG</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>115-545-166</td>
			<td>1 in 100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zeiss epifluorescent microscope A200</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>&#160;with Axiovision software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Q-dot 655 filter</td>
			<td>Chroma</td>
			<td>39107</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

single molecule analysis of laser localized psoralen adducts

תגובת נזק לדנ&quot;א (DDR) התאפיינה בהרחבה במחקרים של הפסקות גדיל כפול (DSBs) המושרה על ידי הקרנה קרן מיקרו לייזר בתאים חיים. המזרח-גרמנית Helix מעוותת שינויים DNA קוולנטי, כולל crosslinks interstrand DNA (ICLs), הוא לא כמו גם מוגדר. למדנו את DDR מגורה על ידי ICLs, למקום על ידי לייזר photoactivation של psoralens immunotagged, האצור בגרעיני התאים לחיות. על מנת לענות על שאלות בסיסיות אודות חלוקת adduct ומפגשים מזלג שכפול, שילבנו לוקליזציה לייזר עם שתי טכנולוגיות אחרות. סיבים DNA משמשים לעתים קרובות כדי להציג את ההתקדמות של מזלגות שכפול ידי immunofluorescence של אנלוגים nucleoside שולבו במהלך פולסים קצרים. נקודות Immunoquantum הועסקו נרחב עבור הדמית מולקולה בודדת. לפי הגישה החדשה, סיבים DNA מתאי נושאת ICLs מקומי לייזר פרוסים על גבי שקופיות מיקרוסקופ. ICLs מתויגת מוצגת עם נקודות immunoquantum ו המרחקי e-נגע השאר נקבעו. שכפול מזלג התנגשויות עם ICLs ניתן דמיינו ודפוסי מפגש שונים מזוהים ונרשמים.

Dig-TMP מקומי לייזר (איור 1A) ICLs ניתן להציג על ידי immunofluorescence נגד Dig-תג צמוד psoralen. למרות הליזר יכול להיות הופנה לשבות בשטח של איזשהו חלק, פסים הם לא &quot;טבעיות&quot; צורות בתאים, אותות לגיטימיים ניתן להבחין בקלות בין חפצים בשל כריכה הלא ספציפית על ידי נוגדנים ראשוניים או משניים. תכונה זו שימושית בעת שימוש נוגדנים של פחות מ סגולי מושלם. דוגמא של הסמן הידוע של DDR, γ-H2AX, הוארה בפס ICLs Dig-TMP מוצגת באיור 1B. Immunofluorescence של Dig מתויג נגעים ב הפסים לייזר אינו מאפשר שום מסקנות לגבי התדירות ואת המרווח של adducts. על מנת להפוך את התאים להגדרה זו הודגרו עם CldU עבור 24 שעות לפני כניסתה של ICLs. מכתים נגד הדואר CldU מאפשרת ויזואליזציה של Dig מתויגת נגעים על סיבים ארוכים מניבה דפוסי סיבים ברורים יותר כתמים ישירים כגון DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole) או YOYO {1,1&#39; - (4,4,8 , 8-tetramethyl-4,8-diazaundecamethylene) bis [4 - [(3-methylbenzo-1,3-oxazol-2-י.ל) methylidene] -l, 4-dihydroquinolinium] tetraiodide}. לאחר כניסתה של ICLs ידי לייזר photoactivation, סיבים הופצו מן התאים הממוקדים. ניתוח אותות Dig על הסיבים כגון אלה שמוצגים באיור 2 חשף כי מרחקי כיל השאר נעו בין פחות מ 10 KB עד יותר מ 160 kb, כמתואר בפרסום האחרון שלנו 21. לא היו שום ראיות adducts מקובצים. לכן הפס של תג Dig, ואת ההצטברות של חלבוני DDR ב הפס, שקף את הנוכחות של נגעים מופרדים היטב, לפחות כפי שנמדד לאורך הדנ&quot;א המורחבת. נחשב מבחינת הכרומטין סלולארי אם ICLs נוצר מערכי nucleosomal, עם 6לקפל דחיסה של אורך DNA המורחבת, הם עדיין יהיו מופרדים השווה לכ 1.6 kb של DNA. ניסויים הכוללים נזק לדנ&quot;א המושרה לייזר בדרך כלל לבצע את הגיוס של DDR. ניסויים אלה לעיתים נדירות נוגעים בשאלות לגבי שכפול ה- DNA. מצד השני, מבחני סיב DNA משמשים בדרך כלל עבור מחקרים של שכפול. חשיפה של תאים כדי פולסים קצרים של תוצאות אנלוגים nucleoside תולדותיהן ב והכללתם DNA. ניתוח Immunofluorescence של סיבי DNA מגלה שטחים של אנלוגים משולבים המייצגים סינתזת DNA אחרונה. זה היה העניין לשאול אם שכפול הדנ&quot;א התרחש הליזר מקומי פסי כיל, ואם כן, מה יהיה הדפוס שכפול בסביבה של ICLs? התאים הודגרו במשך 24 שעות עם CldU כדי להקל התצוגה של סיבים ארוכים. ICLs לייזר מקומי הוכנסו לתאי ואחריהם פולס 1 h של IdU. דנ&quot;א F<html> ibers הוכנו מן התאים הממוקדים ואת Dig מתויג ICLs ואת השטחים שהכפולים מוצגים. התוצאות הצביעו על כך שהפעלת לייזר של psoralen אינו כבה שכפול או להשפיע על התדר הכללי של דפוסי שכפול. שכפול התרחש בצד אחד, וגם על שני הצדדים של ICLs, עם דפוסי דו צדדי בתוך 4: הרוב 1 כפי שהראינו 21 לאחרונה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55541/55541fig1.jpg" /> איור 1: הדור של לייזר מותאם למקום Dig-TMP ICLs. (א) מבנה של psoralen Dig-trimethyl. (ב) צבירת γ-H2AX (ירוק) ב ROI המכיל ICLs לייזר מקומי (Dig, אדום). הגרעין הוא מגואלות DAPI (כחול). תמונת brightfield מראה תא חלקית על הסימן שנעשה על ידי עט היהלום. שימו לב nucleoli, ואת המיקום של ROI מחוץ להם.csource.jove.com/files/ftp_upload/55541/55541fig1large.jpg&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55541/55541fig2.jpg" /> איור 2: סיבים DNA עם לייזר מותאם למקום Dig-TMP אותות. (א) התאים הודגרו במשך 24 שעות עם CldU לתייג DNA. ואז ICLs לייזר מקומי הוכנסו ו (ב) התאים נקצרו הסיבים להתפשט. (C, D) אותות Dig הוצגו עם נקודת immunoquantum (אדום) ואת CldU ידי immunofluorescence (ירוק). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55541/55541fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts at JoVE.com

Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

לייזרים משמשים לעתים קרובות במחקרים של התגובה התאית לנזקי DNA. עם זאת, הם מייצרים נגעים אשר מרווח, תדירות, ואת התנגשויות עם מזלגות שכפולים נדירות מאופיינות. כאן, אנו מתארים גישה המאפשרת קביעת פרמטרים אלה עם crosslinks interstrand לייזר מקומי.

ניתוח מולקולה בודדת של מותאמת לשפה לייזר Psoralen Adducts

The DNA Damage Response (DDR) has been extensively characterized in studies of double strand breaks (DSBs) induced by laser micro beam irradiation in live ...

single-molecule-analysis-of-laser-localized-psoralen-adducts

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

6.6K Views.  National Institute on Aging, National Institutes of Health.  לייזרים משמשים לעתים קרובות במחקרים של התגובה התאית לנזקי DNA. עם זאת, הם מייצרים נגעים אשר מרווח, תדירות, ואת התנגשויות עם מזלגות שכפולים נדירות מאופיינות. כאן, אנו מתארים גישה המאפשרת קביעת פרמטרים אלה עם crosslinks interstrand לייזר מקומי. 

Video: Single Molecule Analysis of Laser Localized Psoralen Adducts

Laser-assisted Cytoplasmic Microinjection in Livestock Zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can create genetic modifications that will be present in every cell of an adult organism. It can also be used to deliver siRNA, mRNAs or blocking antibodies to study gene function in preimplantation embryos. The conventional technique for microinjecting embryos used in rodents consists of a very thin micropipette that directly penetrates the plasma membrane when advanced into the embryo. When this technique is applied to livestock animals it usually results in low efficiency. This is mainly because in contrast to mice and rats, bovine, ovine, and porcine zygotes have a very dark cytoplasm and a highly elastic plasma membrane that makes visualization during injection and penetration of the plasma membrane hard to achieve. In this protocol, we describe a suitable microinjection method for the delivery of solutions into the cytoplasm of cattle zygotes that has proved to be successful for sheep and pig embryos as well. First, a laser is used to create a hole in the zona pellucida. Then a blunt-end glass micropipette is introduced through the hole and advanced until the tip of the needle reaches about 3/4 into the embryo. Then, the plasma membrane is broken by aspiration of cytoplasmic content inside the needle. Finally, the aspirated cytoplasmic content followed by the solution of interest is injected back into the embryonic cytoplasm. This protocol has been successfully used for the delivery of different solutions into bovine and ovine zygotes with 100% efficiency, minimal lysis, and normal blastocysts development rates.

This protocol shows how to perform cytoplasmic microinjection in farm animal zygotes. This technique can be used to deliver any solution into the one-cell embryo such as genome editing tools to generate knockout animals.

לייזר בסיוע cytoplasmic Microinjection ב משק חי zygotes

Cytoplasmic microinjection into one-cell embryos is a very powerful technique. As an example, it enables the delivery of genome editing tools that can ...

Metagenomic Analysis of Silage

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of the microbial communities present within them. Two main metagenomic approaches exist; sequencing the 16S rRNA gene coding region, which exhibits sufficient variation between taxa for identification, and shotgun sequencing, in which genomes of the organisms that are present in the sample are analyzed and ascribed to "operational taxonomic units"; species, genera or families depending on the extent of sequencing coverage. 
In this study, shotgun sequencing was used to analyze the microbial community present in cattle silage and, coupled with a range of bioinformatics tools to quality check and filter the DNA sequence reads, perform taxonomic classification of the microbial populations present within the sampled silage, and achieve functional annotation of the sequences. These methods were employed to identify potentially harmful bacteria that existed within the silage, an indication of silage spoilage. If spoiled silage is not remediated, then upon ingestion it could be potentially fatal to the livestock.

Metagenomics was used to investigate the microbiome of silage cattle feed. Analysis was performed by shotgun sequencing. This approach was used to characterize the composition of the microbial community within the cattle feed.

Metagenomic ניתוח של תחמיץ

Metagenomics is defined as the direct analysis of deoxyribonucleic acid (DNA) purified from environmental samples and enables taxonomic identification of ...

Detection of Copy Number Alterations Using Single Cell Sequencing

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and microbial populations. Traditional methods for assessing genetic heterogeneity have been limited by low resolution, low sensitivity, and/or low specificity. Single cell sequencing has emerged as a powerful tool for detecting genetic heterogeneity with high resolution, high sensitivity and, when appropriately analyzed, high specificity. Here we provide a protocol for the isolation, whole genome amplification, sequencing, and analysis of single cells. Our approach allows for the reliable identification of megabase-scale copy number variants in single cells. However, aspects of this protocol can also be applied to investigate other types of genetic alterations in single cells.

Single cell sequencing is an increasingly popular and accessible tool for addressing genomic changes at high resolution. We provide a protocol that uses single cell sequencing to identify copy number alterations in single cells.

איתור של שינוי מספר העתקה באמצעות רצף תא יחיד

Detection of genomic changes at single cell resolution is important for characterizing genetic heterogeneity and evolution in normal tissues, cancers, and ...

Mapping RNA-RNA Interactions Globally Using Biotinylated Psoralen

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA interactions such as microRNA-mRNA interactions have been shown to regulate gene expression, the full extent to which RNA interactions occur in the cell is still unknown. Previous methods to study RNA interactions have primarily focused on subsets of RNAs that are interacting with a particular protein or RNA species. Here, we detail a method named Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH) that allows genome-wide capture of RNA interactions in vivo in an unbiased manner. SPLASH utilizes in vivo crosslinking, proximity ligation, and high throughput sequencing to identify intramolecular and intermolecular RNA base-pairing partners globally. SPLASH can be applied to different organisms including bacteria, yeast and human cells, as well as diverse cellular conditions to facilitate the understanding of the dynamics of RNA organization under diverse cellular contexts. The entire experimental SPLASH protocol takes about 5 days to complete and the computational workflow takes about 7 days to complete.

Here, we detail the method of Sequencing of Psoralen crosslinked, Ligated, and Selected Hybrids (SPLASH), which enables genome-wide mapping of intramolecular and intermolecular RNA-RNA interactions in vivo. SPLASH can be applied to study RNA interactomes of organisms including yeast, bacteria and humans.

מיפוי RNA-RNA אינטראקציות גלובלי באמצעות Psoralen Biotinylated

Knowing how RNAs interact with themselves and with others is key to understanding RNA based gene regulation in the cell. While examples of RNA-RNA ...

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation became a valuable experimental tool to investigate the DNA damage response (DDR) in vivo. It allows real-time high-resolution single-cell analysis of macromolecular dynamics in response to laser-induced damage confined to a submicrometer region in the cell nucleus. However, various laser conditions have been used without appreciation of differences in the types of damage induced. As a result, the nature of the damage is often not well characterized or controlled, causing apparent inconsistencies in the recruitment or modification profiles. We demonstrated that different irradiation conditions (i.e., different wavelengths as well as different input powers (irradiances) of a femtosecond (fs) near-infrared (NIR) laser) induced distinct DDR and repair protein assemblies. This reflects the type of DNA damage produced. This protocol describes how titration of laser input power allows induction of different amounts and complexities of DNA damage, which can easily be monitored by detection of base and crosslinking damages, differential poly (ADP-ribose) (PAR) signaling, and pathway-specific repair factor assemblies at damage sites. Once the damage conditions are determined, it is possible to investigate the effects of different damage complexity and differential damage signaling as well as depletion of upstream factor(s) on any factor of interest.

Laser Microirradiation to Study In Vivo Cellular Responses to Simple and Complex DNA Damage

The goal of this protocol is to describe how to use laser microirradiation to induce different types of DNA damage, including relatively simple strand breaks and complex damage, to study DNA damage signaling and repair factor assembly at damage sites in vivo.

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

DNA damage induces specific signaling and repair responses in the cell, which is critical for protection of genome integrity. Laser microirradiation ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

חקירה של חלבון הגיוס נגעים הדנ א באמצעות 405 ננומטר לייזר מיקרו-הקרנה

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת ב באתרו הכלאה (smFISH) ניתוח הנצה גידול וגטטיבי שמרים, מיוזה

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Using In Vitro and In-cell SHAPE to Investigate Small Molecule Induced Pre-mRNA Structural Changes

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences is desired. We herein provide a detailed in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) protocol to study the RNA structural change in the presence of an experimental drug for spinal muscular atrophy (SMA), survival of motor neuron (SMN)-C2, and in exon 7 of the pre-mRNA of the SMN2 gene. In in vitro SHAPE, an RNA sequence of 140 nucleotides containing SMN2 exon 7 is transcribed by T7 RNA polymerase, folded in the presence of SMN-C2, and subsequently modified by a mild 2&#39;-OH acylation reagent, 2-methylnicotinic acid imidazolide (NAI). This 2&#39;-OH-NAI adduct is further probed by a 32P-labeled primer extension and resolved by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE). Conversely, 2&#39;-OH acylation in in-cell SHAPE takes place in situ with SMN-C2 bound cellular RNA in living cells. The pre-mRNA sequence of exon 7 in the SMN2 gene, along with SHAPE-induced mutations in the primer extension, was then amplified by PCR and subject to next-generation sequencing. Comparing the two methodologies, in vitro SHAPE is a more cost-effective method and does not require computational power to visualize results. However, the in vitro SHAPE-derived RNA model sometimes deviates from the secondary structure in a cellular context, likely due to the loss of all interactions with RNA-binding proteins. In-cell SHAPE does not need a radioactive material workplace and yields a more accurate RNA secondary structure in the cellular context. Furthermore, in-cell SHAPE is usually applicable for a larger range of RNA sequences (~1,000 nucleotides) by utilizing next-generation sequencing, compared to in vitro SHAPE (~200 nucleotides) that usually relies on PAGE analysis. In case of exon 7 in SMN2 pre-mRNA, the in vitro and in-cell SHAPE derived RNA models are similar to each other.

Detailed protocols for both in vitro and in-cell selective 2&#39;-hydroxyl acylation analyzed by primer extension (SHAPE) experiments to determine the secondary structure of pre-mRNA sequences of interest in the presence of an RNA-targeting small molecule are presented in this article.

שימוש בחוץ גופית וצורה בתא לחקור מולקולה קטנה המושרה שינויים מבניים Pre-mRNA

In the process of drug development of RNA-targeting small molecules, elucidating the structural changes upon their interactions with target RNA sequences ...

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization (SM-FISH) to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

Current methods routinely used to quantify mRNA in oocytes and embryos include digital reverse-transcription polymerase chain reaction (dPCR), quantitative, real-time RT-PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing. When these techniques are performed using a single oocyte or embryo, low-copy mRNAs are not reliably detected. To overcome this problem, oocytes or embryos can be pooled together for analysis; however, this often leads to high variability amongst samples. In this protocol, we describe the use of fluorescence in situ hybridization (FISH) using branched DNA chemistry. This technique identifies the spatial pattern of mRNAs in individual cells. When the technique is coupled with Spot Finding and Tracking&#160;computer software, the abundance of mRNAs in the cell can also be quantified. Using this technique, there is reduced variability within an experimental group and fewer oocytes and embryos are required to detect significant differences between experimental groups. Commercially available branched-DNA SM-FISH kits have been optimized to detect mRNAs in sectioned tissues or adherent cells on slides. However, oocytes do not effectively adhere to slides and some reagents in the kit were too harsh resulting in oocyte lysis. To prevent this lysis, several modifications were made to the FISH kit. Specifically, oocyte permeabilization and wash&#160;buffers designed for the immunofluorescence of oocytes and embryos replaced the proprietary buffers. The permeabilization, washes, and incubations with probes and amplifier were performed in 6-well plates and oocytes were placed on slides at the end of the protocol using mounting media. These modifications were able to overcome the limitations of the commercially available kit, in particular, the oocyte lysis. To accurately and reproducibly count the number of mRNAs in individual oocytes, computer software was used. Together, this protocol represents an alternative to PCR and sequencing to compare the expression of specific transcripts in single cells.

Use of Single Molecule Fluorescent In Situ Hybridization SM-FISH to Quantify and Localize mRNAs in Murine Oocytes

To reproducibly count the numbers of mRNAs in individual oocytes, single molecule RNA fluorescence in situ hybridization (RNA-FISH) was optimized for non-adherent cells. Oocytes were collected, hybridized with the transcript specific probes, and quantified using an image quantification software.