Neisseria meningitidis הוא אחד הגורמים השכיחים ביותר של אלח דם ו meningitidis בקרב האוכלוסייה האנושית בכל רחבי העולם, ואת החיידקים מוגבל המארח האנושי. בפרוטוקול ניסיוני זה, נתאר את ההליך המותאם לאינדוקוקלי מנינגיטידיס במודל עכבר המבוסס על חיסון תוך-ריחיים של חיידקים. מודל מורין זה שחזר את האירועים הפתולוגיים האופייניים של דלקת קרום המוח מנינגוקוקית כמחלה אנושית חמורה.
לכן, הוא מייצג כלי שימושי כדי להעריך את האינטראקציה המארח-פתוגן ולנתח את המנגנון הפתוגנטי האחראי למחלה קטלנית זו. מודל הזיהום יכול להיות שימושי לא רק כדי להעריך אסטרטגיה טיפולית חדשנית כדי למנוע שכפול חיידקים ישירות לתוך CSF, אלא גם כדי לנתח את היעילות של אימונותרפיה פסיבית אפשרית נגד פתוגנים אנושיים. הטכניקה דורשת את שלב האימון כדי להבטיח את ההצלחה לא רק של inoculum intracisternal, אבל יותר באופן כללי אינדוקציה המחלה.
הדגמת ההליכים תהיה רוברטה קוליצ'יו וקיארה פליוקה כחוקרים, ואלנה סקליונה כסטודנטית לדוקטורט, הכל על ידי המעבדה שלי. כדי להתחיל, לבחור מושבה אחת מתרבות מנינגיטידיס Neisseria טרי על צלחת אגר gonococcal בתוספת 1% תוסף פוליביטוקס לחסן ב 10 מיליליטר GC מרק. כל ההליכים הכרוכים בשימוש במנינגוקוצ'י חייבים להיעשות תחת ארון קוביות בטיחות ביו זרימה למינארית.
לגדל את החיידקים ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור לנער מסלולית ב 220 סל"ד ולהמשיך לבדוק את הצפיפות האופטית של התרבות בנקודות זמן שונות עם ספקטרופוטומטר. לגדל את התרבות עד שהוא מגיע OD600 של 0.7 המתאים לשלב המעריכי המוקדם. לאחר צפיפות אופטית זו מתקבלת, להפוך מניות קפואות על ידי הוספת 10% גליצרול וחלוקת מיליליטר אחד של התרבות בקבוקונים cryo.
יש לאחסן את הבקבוקונים ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. לפני הזיהום, להפשיר חיידקים קפואים בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן להעביר לתוך צינור צנטריפוגה בצנטריפוגה במשך 15 דקות ב 1500xG הסר את supernatant ולהשעות מחדש במיליליטר אחד של מרק GC טרי המכיל חמישה מיליגרם לקילוגרם ברזל דקסטרן. לפני תחילת הניסוי, לשקול את בעלי החיים ולהעריך את טמפרטורת הגוף שלהם.
לגרוש את החיה מן הצוואר למטה ולחטא את הבטן עם אתנול 70%. כשעתיים לפני הזיהום, באמצעות מחט מד 25, להזריק ברזל dextran תוך-אפית ברביע הימני התחתון של הבטן. לאחר הרדמה של החיה, בדוק את עומק ההרדמה על ידי אישור היעדר תגובת כאב בעת צביטת בוהן.
לאחר הנחת העכבר על ארון הזרימה למינאר למקם אותו דטוביטוס עצם החזה בזהירות למתוח את הגפיים ואת עמוד השדרה הצווארי כדי לשמור על עמוד השדרה במצב ישר. כדי לשמור על השעיה חיידקית עקבית, מערבבים אותו בעדינות לפני טעינתו במזרק עם מחט מד 30 מילימטר. לחטא את הראש עם 70% אתנול.
מניחים את החיה ב recumbency בצד, למשוך את האוזניים מהדרך, ולהגמיש את הצוואר במתינות. ודא כי קו האמצע של הצוואר והראש נמצאים במצב מקביל לחלוטין לראש השולחן. ואז לגעת כנפי האטלס, לוודא שהם חופפים, ולהרגיש את הכניסה הטבעית על קו האמצע שבו המחט היא הסיכוי הטוב ביותר להיכנס לחור העורפי.
למלא מזרק עם מחט 8 מילימטר 30 מד עם המינון החיידקי תת קטלני הוקמה של מנינגוקוקי או ברזל דקסטרן השלים מרק GC כשליטה בנפח כולל של 10 microliters. השתמש במחט כדי לזהות את נקודת ההזרקה ולאחר מכן להזריק את התוכן של המזרק כדי מגנה cisterna של עכברים דרך חור בר העורפי. השלך את המזרק והמחט בבטחה לאחר ההזרקה.
שים את החיה בכלוב מתחת לארון זרימה למינארי. המתינו להתעוררות ולהחלמה מלאה של התנועה והמשיכו להישרדות בעלי החיים על בעלי החיים הנגועים, כמתואר בפרוטוקול. לאחר הרדמה של העכבר, לחטא את החזה עם אתנול 70%.
באמצעות מחט 25 מד למשוך 600 כדי 700 microliters של דם על ידי ניקוב לב של חלל החזה. לאסוף את הדם בצינור המכיל 3.8% נתרן ציטראט ולאחסן ב 80 מעלות צלזיוס עבור הערכת ספירת תאים חיידקיים קיימא מאוחר יותר. הנח את העכבר המתת חום בתנחיית סופין.
באמצעות מספריים ומטליות לחתוך את הפרווה לאורך המישור הסגיטלי של הגוף. עם סיכות, לתקן את העור עם הפרווה בצדי הגוף. השתמש במספריים חדים כדי לחתוך את קרום צפירתי.
לאחר מכן עם מספריים ומלקחיים חד פעמיים, להוציא את האיברים, כגון טחול וכבד, ולשים כל אחד בצלחת פטרי סטרילית נפרדת עם מיליליטר אחד של מרק GC בתוספת 10% גליצרול. באמצעות בוכנה של מזרק חמישה מילימטר, הומוגניזציה האיברים מכנית בטמפרטורת החדר במשך כשתיים עד שלוש דקות עד ההשעיה תא יחיד נוצר ולהעביר אותו בקבוקון קריו מתיש. מניחים את הצינור מיד על הקרח היבש.
הפוך צלחות אגר GC עם אנטיביוטיקה ולייבש אותם לפני השימוש ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים עד שלוש שעות. הכינו 10 דילולים סדרתיים מלאים של הדגימות במרק GC מכל רקמה הומוגנית. צלחת אותם על צלחות אגר GC ודגירה לילה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.
עם 70% אתנול, לחטא את ראשו של עכבר המתת חיטוי. באמצעות מספריים כירורגיים קטנים ומקלפי פלדה עדין, לכרת את הפרווה ואת העור של הראש הוסר, ולאחר מכן להמשיך לכיוון החלק העליון של הגולגולת על מנת לראות בבירור את התפרים כדי להנחות את פתיחת הגולגולת. כדי לפתוח את הגולגולת, הכנס את קצה המספריים הזעירים דרך מגנום הפתח.
חותכים לכיוון מרכז הגולגולת ולאורך קו האמצע של העצםקודית לצד הנגדי של הגולגולת לחתוך בעדינות לאורך האיבר לרוחב של התפר lambdoid. באמצעות מטליות עדין, החל מהפינהקודית האחורית, להרים את הגולגולת ולמשוך אותו באלכסון כלפי מעלה כדי לגלות את המוח, לוודא כי רקמת המוח אינו מחובר לכל עצם של הראש כאשר הגולגולת מורמת. השתמש מדפים חד פעמיים כדי להסיר כל רקמת חיבור בין הגולגולת למוח ולא לאפשר את רקמת המוח להתייבש.
השתמש ממטרים חד פעמיים מיד למקם את המוח בצלחת פטרי עם מיליליטר אחד של מרק GC בתוספת 10% גליצרול. השתמש הבוכנה של מזרק חמישה מיליליטר כדי הומוגניזציה המוח מכנית בטמפרטורת החדר במשך כשתיים עד שלוש דקות עד השעיה חד-תאית נוצרת. להעביר את ההשעיה לתוך צינור סטרילי 2 מיליליטר ולאחסן ב 80 מעלות צלזיוס עבור תא חיידקי קיימא מאוחר יותר ספירת הערכה.
הישרדותם של עכברים נגועים 93/4286 סוג פראי או cssA פגום Neisseria meningitidis זנים הוערכו. המינון הקטלני החציוני של הזן הפראי התאים לאתגר מנינגוקוק של 10 עד CFU הרביעי. בעוד ששיעור התמותה 10 עד CFU 5 היה שווה ל 83.4% ו 100% עם 10 עד מינון CFU 5.
על מנת להשיג את המינון הקטלני החציוני עבור זן מוטציה פגום cssA, מנה של 10 ל- CFU 8 היה הכרחי ואת הסכום 1000 קפלים גבוה יותר מאשר זן מסוג פראי. לאחר ההזרקה, חלה עלייה מהירה של חיידקים מסוג בר ברקמת המוח שהגיעו לשיא בסביבות 24 שעות לאחר ההדבקה. במוחם של עכברים הנגועים בזן המוטנטים, הספירות המעשית ירדו בהדרגה עם הזמן.
כמו כן, 33.3% מהעכברים הנגועים במוטנטים הראו סיווג חיידקי מאתר ההדבקה, בניגוד לבעלי חיים נגועים מסוג פראי. 48 שעות לאחר הזיהום, המוטנט הפגום cssA נוקה לחלוטין בטחול ובכבד, ואילו בעלי החיים הנגועים בזן מסוג הבר הפגינו זיהום מתמשך. השיטה הניסיונית המתוארת יכולה להיות שימושית כדי לנתח נזק מוחי הקשור למחלה קטלנית זו, על ידי הערכה פתולוגית שלה, כגון אימונוהיסטוכימיה, immunofluorescence, וניתוח דימום מוחי.
