التهاب السحايا النيسيرية هو واحد من الأسباب الأكثر شيوعا للتعفن والتهاب السحايا بين السكان في جميع أنحاء العالم، والبكتيريا تقتصر على المضيف البشري. في هذا البروتوكول التجريبي ، سنصف الإجراء المصمم خصيصًا لاستقراء التهاب السحايا السحائي في نموذج فأر قائم على تلقيح البكتيريا. هذا النموذج murine استنساخ الأحداث المرضية المميزة لالتهاب السحايا المكورات السحائية باعتبارها مرضاً بشرياً شديداً.
لذلك، فإنه يمثل أداة مفيدة لتقييم التفاعل المضيف الممرض وتحليل آلية الإمراض المسؤولة عن هذا المرض القاتل. يمكن أن يكون نموذج العدوى مفيدًا ليس فقط لتقييم الاستراتيجية العلاجية المبتكرة لمنع تكرار البكتيريا مباشرة في CSF ، ولكن أيضًا لتحليل فعالية العلاج المناعي السلبي المحتمل ضد مسببات الأمراض البشرية. تتطلب هذه التقنية مرحلة التدريب لضمان نجاح ليس فقط من inoculum inocisternal، ولكن بشكل عام أكثر تحريض المرض.
وسوف يكون إثبات الإجراءات روبرتا كوليتشيو وChiara Pagliuca والباحثين، وايلينا Scaglione كطالب دكتوراه، وكلها من قبل مختبري. للبدء، واختيار مستعمرة واحدة من ثقافة التهاب السحايا Neisseria جديدة على لوحة agar gonococcal تكملها مع ملحق بوليبيتوكسي 1٪والتطعيم في 10 ملليلتر GC مرق. يجب أن يتم جميع الإجراءات التي تنطوي على استخدام المكورات السحائية تحت تدفق مفارز السلامة البيولوجية مكعب مجلس الوزراء.
زراعة البكتيريا في 37 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز المداري في 220 دورة في الدقيقة والحفاظ على التحقق من الكثافة البصرية للثقافة في نقاط زمنية مختلفة مع مقياس الطيفي. تنمو الثقافة حتى تصل إلى OD600 من 0.7 المقابلة للمرحلة الأسية في وقت مبكر. مرة واحدة يتم الحصول على هذه الكثافة البصرية، وجعل الأسهم المجمدة بإضافة 10٪ الجلسرين والاستغناء عن ملليلتر واحد من الثقافة في قارورة التبريد.
تخزين قارورة في 80 درجة مئوية حتى الاستخدام. قبل العدوى، ذوبان البكتيريا المجمدة في درجة حرارة الغرفة، ثم نقلها إلى أنبوب الطرد المركزي في الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 1500xG إزالة فائقة وإعادة تعليق في ملليلتر واحد من مرق GC الطازجة التي تحتوي على خمسة ملليغرام لكل كيلوغرام الحديد دستران. قبل البدء في التجربة، وزن الحيوانات وتقييم درجة حرارة الجسم.
يُجرّق الحيوان من الرقبة إلى الأسفل ويطهر البطن بـ 70٪ من الإيثانول. ما يقرب من 2 ساعة قبل العدوى، وذلك باستخدام إبرة قياس 25، وحقن الحديد dextran intraperitoneally في الربع الأيمن السفلي من البطن. بعد تخدير الحيوان ، تحقق من عمق التخدير عن طريق تأكيد عدم وجود استجابة للألم عند قرص إصبع قدمه.
بعد وضع الماوس على موقف مجلس الوزراء تدفق لارينار في ديسوبتوس صارمة وتمتد بعناية الأطراف والعمود الفقري العنقي للحفاظ على العمود الفقري في وضع مستقيم. للحفاظ على تعليق بكتيري ثابت ، اخلطه بلطف قبل تحميله في حقنة مع إبرة قياس 30 ملليمترًا عيارًا ثمانية ملليمترات. تطهير الرأس مع الإيثانول 70٪.
وضع الحيوان في إعادة شغل الرأس الجانبي، وسحب الأذنين للخروج من الطريق، وثني الرقبة باعتدال. تأكد من أن خط الوسط في الرقبة والرأس في وضعية متوازية تماما إلى أعلى الجدول. ثم المس أجنحة الأطلس، والتأكد من تداخلها، والشعور بالمسافات البادئة الطبيعية على خط الوسط حيث من المرجح أن تدخل الإبرة الثقب القذالي.
ملء حقنة مع إبرة قياس 8 ملليمتر 30 مع الجرعة البكتيرية شبه القاتلة المنشأة من المكورات السحائية أو dextran الحديد تكمل GC مرق كتحكم في حجم إجمالي قدره 10 ميكرولترات. استخدام الإبرة لتحديد نقطة الحقن ومن ثم حقن محتوى الحقنة إلى ماغنا cisterna الفئران من خلال ثقب دبر القذالي. تخلص من الحقنة والإبرة بأمان بعد الحقن.
وضع الحيوان في القفص تحت خزانة تدفق لارينار. انتظر الصحوة والانتعاش الكامل للحركة والمضي قدما لبقاء الحيوان على الحيوانات المصابة ، كما هو موضح في البروتوكول. بعد تخدير الماوس، وتطهير الصدر مع الإيثانول 70٪.
باستخدام إبرة قياس 25 سحب 600 إلى 700 ميكرولترات من الدم عن طريق ثقب القلب من تجويف الصدر. جمع الدم في أنبوب يحتوي على 3.8٪ سيترات الصوديوم وتخزينها في 80 درجة مئوية لتقييم تعداد الخلايا البكتيرية القابلة للحياة في وقت لاحق. وضع الفأر القتل الرحيم في موقف سوبين.
باستخدام مقص ملقط قطع الفراء على طول الطائرة القوس من الجسم. مع دبابيس، وإصلاح الجلد مع الفراء على جانبي الجسم. استخدام مقص حاد لقطع الغشاء البريتوني.
ثم مع مقص ملقط المتاح، مكوس الأجهزة، مثل الطحال والكبد، ووضع كل في طبق بيتري معقمة منفصلة مع ملليلتر واحد من مرق GC تكملها مع 10٪ غليسيرول. باستخدام المكبس من حقنة خمسة ملليمترات، التجانس الأجهزة ميكانيكيا في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق حتى يتم تشكيل تعليق خلية واحدة ونقلها إلى قارورة التبريد المسير. ضع الأنبوب على الفور على الجليد الجاف.
جعل GC لوحات أجار مع المضادات الحيوية وتجفيفها قبل استخدامها في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات. إعداد 10 تخفيفات المسلسل الكامل للعينات في مرق GC من كل أنسجة متجانسة. لوحة لهم على لوحات GC أجار واحتضان بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
مع 70٪ الإيثانول، وتطهير رأس الماوس القتل الرحيم. باستخدام مقص جراحي صغير وملقط فولاذي ذو رؤوس دقيقة ، قم باستئصال الفراء وجلد الرأس الذي تمت إزالته ، ثم انتقل نحو أعلى الجمجمة من أجل رؤية الخيوط بوضوح وتوجيه فتح الجمجمة. لفتح الجمجمة، أدخل طرف مقص صغير من خلال ماغنوم الهضان.
قطع نحو مركز الجمجمة وعبر خط الوسط من العظام الجدارية إلى الجانب الآخر من الجمجمة وقطع بلطف على طول الطرف الجانبي من خياطة لامدويد. باستخدام ملقط ذات رؤوس دقيقة ، بدءًا من الزاوية الجدارية الخلفية ، ارفع الجمجمة واسحبه إلى الأعلى بشكل قطري لاكتشاف الدماغ ، مع التأكد من عدم ربط أنسجة الدماغ بأي عظمة في الرأس عند رفع الجمجمة. استخدام ملقط المتاح لإزالة أي نسيج الضام بين الجمجمة والدماغ ولا تسمح أنسجة الدماغ لتجف.
استخدام ملقط المتاح لوضع الدماغ على الفور في طبق بيتري مع ملليلتر واحد من مرق GC تكملة مع 10٪ الجلسرين. استخدام المكبس من حقنة خمسة ملليلتر لتجانس الدماغ ميكانيكيا في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق حتى يتم تشكيل تعليق خلية واحدة. نقل التعليق إلى أنبوب معقمة 2 ملليلتر وتخزينها في 80 درجة مئوية لتقييم تعداد الخلايا البكتيرية القابلة للحياة في وقت لاحق.
تم تقييم بقاء الفئران المصابة بـ 93/4286 من النوع البري أو cssA المصابة بسلالات التهاب السحايا Neisseria المعيبة. الجرعة القاتلة المتوسطة للسلالات البرية من نوع تتوافق مع تحدي المكورات السحائية من 10 إلى CFU 4. في حين أن معدل الوفيات 10 إلى 5 CFU كان يساوي 83.4٪ و 100٪ مع 10 إلى الجرعة CFU 5.
من أجل الحصول على الجرعة القاتلة المتوسطة لسلالات متحولة معيبة cssA ، كان من الضروري جرعة من 10 إلى 8 CFU وكمية 1000 أضعاف أعلى من سلالة من النوع البري. بعد الحقن، كانت هناك زيادة سريعة من البكتيريا من النوع البري في أنسجة الدماغ تصل إلى ذروتها في حوالي 24 ساعة بعد العدوى. في دماغ الفئران المصابة سلالة متحولة، انخفض عدد قابلة للحياة تدريجيا مع مرور الوقت.
أيضا، أظهرت 33.3٪ من الفئران المصابة المتحولة إزالة البكتيريا من موقع العدوى، على عكس الحيوانات المصابة من النوع البري. بعد 48 ساعة من العدوى ، تم مسح المتحولة المعيبة cssA تمامًا في الطحال والكبد ، في حين أن الحيوانات المصابة بالإجهاد البري أظهرت عدوى مستمرة. يمكن أن تكون الطريقة التجريبية الموصوفة مفيدة لتحليل تلف الدماغ المرتبط بهذا المرض القاتل ، من خلال تقييمها المرضي ، مثل الكيمياء المناعية ، والفلوروس المناعي ، وتحليل النزيف الدماغي.
