Neisseria meningitidis è una delle cause più comuni di sepsi e meningitidi tra la popolazione umana di tutto il mondo, e il batterio è limitato all'ospite umano. In questo protocollo sperimentale, descriveremo la procedura su misura per l'induzione della meningitidis meningococcica in un modello di topo basato sull'inoculazione intracisternale dei batteri. Questo modello murino riproduceva i caratteristici eventi patologici della meningite meningococcica come una grave malattia umana.
Quindi, rappresenta uno strumento utile per valutare l'interazione ospite-patogeno e per analizzare il meccanismo patogenetico responsabile di questa malattia letale. Il modello di infezione potrebbe essere utile non solo per valutare una strategia terapeutica innovativa per prevenire la replicazione batterica direttamente nel CSF, ma anche per analizzare l'efficacia di una possibile immunoterapia passiva contro gli agenti patogeni umani. La tecnica richiede la fase di allenamento per garantire il successo non solo dell'inoculo intracisternale, ma più in generale dell'induzione della malattia.
A dimostrare le procedure saranno Roberta Colicchio e Chiara Pagliuca come ricercatrici, ed Elena Scaglione come dottoranda, tutte del mio laboratorio. Per iniziare, scegli una singola colonia da una fresca coltura di Neisseria meningitidis sulla piastra di agar gonococcico integrata con integratore di polibitox all'1% e inoculata in brodo GC da 10 millilitri. Tutte le procedure che prevedono l'uso di meningococchi devono essere fatte sotto un armadio a cubo di sicurezza bio a flusso laminare.
Far crescere i batteri a 37 gradi Celsius in un incubatore di scuotimenti orbitali a 220 RPM e continuare a controllare la densità ottica della coltura in diversi punti di tempo con uno spettrofotometro. Far crescere la cultura fino a raggiungere OD600 di 0,7 corrispondente alla fase esponenziale iniziale. Una volta ottenuta questa densità ottica, fare scorte congelate aggiungendo il 10% di glicerolo e erogando un millilitro della coltura nelle fiale criogeniche.
Conservare le fiale a 80 gradi Celsius fino all'uso. Prima dell'infezione, scongelare i batteri congelati a temperatura ambiente, quindi trasferirli in un tubo di centrifuga in centrifuga per 15 minuti a 1500xG Rimuovere il supernatante e sospendere di nuovo a un millilitro di brodo GC fresco contenente cinque milligrammi per chilogrammo di dextran di ferro. Prima di iniziare l'esperimento, pesare gli animali e valutare la loro temperatura corporea.
Scuff l'animale dal collo verso il basso e disinfettare l'addome con un 70% di etanolo. Circa 2 ore prima dell'infezione, utilizzando un ago calibro 25, iniettare dextran di ferro per via intraperitoneale nel quadrante in basso a destra dell'addome. Dopo aver anestetizzato l'animale, controllare la profondità dell'anestesia confermando l'assenza di risposta al dolore dopo aver pizzicato l'allieta.
Dopo aver posizionato il mouse sull'armadio di flusso laminare, posizionarlo in decubito sternale e allungare accuratamente gli arti e la colonna cervicale per mantenere la colonna vertebrale in posizione dritta. Per mantenere una sospensione batterica costante, mescolarla delicatamente prima di caricarla in una siringa con un ago calibro 30 di otto millimetri. Disinfettare la testa con un 70% di etanolo.
Posizionare l'animale in recumbency laterale, estrarre le orecchie di mezzo e flettere moderatamente il collo. Assicurarsi che la linea mediana del collo e la testa siano in posizione perfettamente parallela al piano del tavolo. Quindi toccare le ali dell'atlante, assicurandosi che si sovrappongano e sentire l'indentazione naturale sulla linea mediana in cui è più probabile che l'ago entri nel foro occipitale.
Riempire una siringa con un ago calibro 8 millimetri e 30 con la dose batterica sublettale stabilita di meningococchi o dextran di ferro integrata GC Broth come controllo in un volume totale di 10 microlitri. Utilizzare l'ago per identificare il punto di iniezione e quindi iniettare il contenuto della siringa alla cisterna magna dei topi attraverso un foro di bava occipitale. Scartare la siringa e l'ago in modo sicuro dopo l'iniezione.
Posizionare l'animale nella gabbia sotto un armadio a flusso laminare. Attendere il risveglio e il pieno recupero del movimento e procedere per la sopravvivenza animale sugli animali infetti, come descritto nel protocollo. Dopo aver anestetizzato il topo, disinfettare il torace con un 70% di etanolo.
Utilizzando un ago calibro 25 prelevare da 600 a 700 microlitri di sangue per puntura cardiaca della cavità toracica. Raccogliere il sangue in un tubo contenente il 3,8% di citrato di sodio e conservare a 80 gradi Celsius per la successiva valida valutazione del conteggio delle cellule batteriche. Posare il topo eutanasiato in posizione supina.
Usando forbici e forcep tagliare la pelliccia lungo il piano sagittale del corpo. Con i perni, fissare la pelle con la pelliccia sui lati del corpo. Utilizzare forbici affilate per tagliare la membrana peritoneale.
Quindi, con forbici e forcep usa e getta, asportare gli organi, come milza e fegato, e metterli in una piastra di Petri steril separata con un millilitro di brodo GC integrato con 10% glicerolo. Utilizzando uno stantuffo di una siringa da cinque millimetri, omogeneizzare meccanicamente gli organi a temperatura ambiente per circa due o tre minuti fino a formare una sospensione a cella singola e trasferirla in una fiala criogenica. Posizionare immediatamente il tubo sul ghiaccio secco.
Preparare piatti di agar GC con antibiotici e asciugarli prima dell'uso a 37 gradi Celsius per due o tre ore. Preparare 10 diluizioni seriali complete dei campioni in BRODO GC da ogni tessuto omogeneizzato. Placcarli su piastre di agar GC e incubare durante la notte a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica.
Con il 70% di etanolo, disinfettare la testa di un topo eutanasiato. Utilizzando piccole forbici chirurgiche e una forcep in acciaio a punta fine, ritagliare la pelliccia e la pelle della testa rimossa, quindi procedere verso la parte superiore del cranio per vedere chiaramente le suture e guidare l'apertura del cranio. Per aprire il cranio, inserire la punta di piccole forbici attraverso il forame magnum.
Tagliare verso il centro del cranio e attraverso la linea mediana dell'osso parietale sul lato opposto del cranio e tagliare delicatamente lungo l'arto laterale della sutura lambdoide. Usando forcelle a punta fine, partendo dall'angolo parietale posteriore, sollevare il cranio e tirarlo diagonalmente verso l'alto per scoprire il cervello, assicurandosi che il tessuto cerebrale non sia attaccato ad alcun osso della testa quando il cranio viene sollevato. Usa le forcelle usa e getta per rimuovere qualsiasi tessuto connettivo tra il cranio e il cervello e non permettere al tessuto cerebrale di asciugarsi.
Utilizzare forcep usa e getta per posizionare immediatamente il cervello in una piastra di Petri con un millilitro di brodo GC integrato con 10%glicerolo. Utilizzare lo stantuffo di una siringa da cinque millilitri per omogeneizzare meccanicamente il cervello a temperatura ambiente per circa due o tre minuti fino a formare una sospensione a singolo cellula. Trasferire la sospensione in un tubo sterile da 2 millilitri e conservare a 80 gradi Celsius per la successiva valutazione del conteggio delle cellule batteriche praticabile.
È stata valutata la sopravvivenza dei topi infetti da ceppi di Neisseria meningitidis difettosi di tipo selvaggio o cssA. La dose letale mediana per il ceppo di tipo selvatico corrispondeva alla sfida meningococcica di 10 alla 4a CFU. Mentre il tasso di mortalità dal 10 al 5° CFU era pari all'83,4% e al 100% con 10 alla 5a dose di CFU.
Per ottenere la dose letale mediana per il ceppo mutante difettoso cssA, era necessaria una dose di 10 all'8 ° CFU e quantità 1000 volte superiore al ceppo di tipo selvatico. Dopo l'iniezione, c'è stato un rapido aumento dei batteri di tipo selvatico nel tessuto cerebrale raggiungendo il picco a circa 24 ore dopo l'infezione. Nel cervello dei topi infettati dal ceppo mutante, i conteggi vitali sono diminuiti progressivamente nel tempo.
Inoltre, il 33,3% dei topi infetti mutanti ha mostrato una clearance batterica dal sito di infezione, a differenza degli animali infetti di tipo selvatico. 48 ore dopo l'infezione, il mutante difettoso cssA è stato completamente eliminato nella milza e nel fegato, mentre gli animali infetti dal ceppo di tipo selvatico hanno mostrato un'infezione persistente. Il metodo sperimentale descritto potrebbe essere utile per analizzare i danni cerebrali associati a questa malattia letale, attraverso la sua valutazione patologica, come l'immunoistochimica, l'immunofluorescenza e l'analisi del sanguinamento cerebrale.
