Neisseria meningitidis является одной из наиболее распространенных причин сепсиса и менингита среди населения во всем мире, и бактерии ограничены для человека хозяина. В этом экспериментальном протоколе мы опишем индивидуальную процедуру индукции менингококкового менингита в мышиной модели, основанной на внутритракционной прививке бактерий. Эта модель мурина воспроизвела характерные патологические явления менингококкового менингита как тяжелое заболевание человека.
Таким образом, он представляет собой полезный инструмент для оценки взаимодействия хозяина и патогена и анализа патогенетического механизма, ответственного за это смертельное заболевание. Модель инфекции может быть полезна не только для оценки инновационной терапевтической стратегии предотвращения репликации бактерий непосредственно в CSF, но и для анализа эффективности возможной пассивной иммунотерапии против патогенных микроорганизмов человека. Техника требует фазы обучения, чтобы гарантировать успех не только intracisternal inoculum, но в большей части в целом индукции болезни.
Демонстрация процедур будет Роберта Colicchio и Кьяра Pagliuca как исследователи, и Елена Scaglione как аспирант, все моей лаборатории. Для начала выберите одну колонию из свежей культуры neisseria meningitidis на гонококковой агарной пластине, дополненной добавкой 1%polybitox и прививкой в 10 миллилитров GC Broth. Все процедуры, которые включают в себя использование менингококков должно быть сделано под ламинарный поток био безопасности куб кабинета.
Выращиваем бактерии при 37 градусах Цельсия в орбитальном инкубаторе при 220 об/мин и продолжайте проверять оптическую плотность культуры в разных точках времени с помощью спектрофотометра. Расти культуры, пока она не достигнет OD600 из 0,7, соответствующих ранней экспоненциальной фазе. После того, как эта оптическая плотность получена, сделать замороженные запасы, добавив 10%глицерола и дозирования одного миллилитра культуры в крио флаконы.
Храните флаконы при 80 градусах по Цельсию до их использования. Перед инфекцией, оттепель замороженных бактерий при комнатной температуре, а затем передать в центрифугу трубки в центрифуге в течение 15 минут при температуре 1500xG Удалить супернатант и повторно приостановить на один миллилитр свежего бульона GC содержащие пять миллиграммов на килограмм железа декстрана. Перед началом эксперимента взвесить животных и оценить температуру их тела.
Потертости животного от шеи вниз и дезинфицировать живот с 70% этанола. Приблизительно за 2 часа до заражения, используя 25 калибровочных игл, вводить железо декстран интраперитонально в нижнем правом квадранте живота. После анестезии животное, проверить на глубину анестезии, подтвердив отсутствие боли при щипать ногой.
После размещения мыши на ламинарном потоке шкаф положение его в кормовой decubitus и тщательно растянуть конечностей и шейного отдела позвоночника, чтобы сохранить позвоночника в прямом положении. Для поддержания последовательной бактериальной суспензии, аккуратно смешайте его перед загрузкой в шприц с восемью миллиметрами 30 калибровочной иглы. Дезинфицировать голову 70% этанола.
Поместите животное в боковой лежачих, вытащить уши в сторону, и сгибать шею умеренно. Убедитесь, что средняя линия шеи и головы находятся в совершенно параллельном положении с столешным верхом. Затем коснитесь крыльев атласа, убедившись, что они перекрываются, и почувствуйте естественную отступ на средней линии, где игла, скорее всего, войдет в затылое отверстие.
Заполните шприц с 8 миллиметров 30 калибровочных игл с установленной сублетальной бактериальной дозы менингококков или железа декстран дополнили GC бульон в качестве контроля в общем объеме 10 микролитров. Используйте иглу, чтобы определить точку инъекции, а затем ввести содержимое шприца в цистерна магна мышей через затылое отверстие заусенцев. Откажитесь от шприца и иглы безопасно после инъекции.
Поместите животное в клетку под шкаф ламинарного потока. Дождись пробуждения и полного восстановления движения и приступайте к выживанию животных на инфицированных животных, как описано в протоколе. После анестезии мыши, дезинфицировать грудь с 70% этанола.
С помощью 25 калибровочных игл изымают от 600 до 700 микролитров крови путем сердечного прокола грудной полости. Соберите кровь в трубке, содержащей 3,8% цитрата натрия и хранить при 80 градусах по Цельсию для более поздней оценки жизнеспособных бактериальных клеток. Положите усыпляемую мышь в положение на спине.
С помощью ножниц и типсов вырезать мех вдоль сагиттаальной плоскости тела. С булавками, исправить кожу с мехом по бокам тела. Используйте острые ножницы, чтобы отрезать перитонеальную мембрану.
Затем ножницами и одноразовыми типсами, акциз органов, таких как селезенка и печень, и положить каждый в отдельной стерильной чашки Петри с одним миллилитром GC бульона дополняется 10%глицерол. Используя поршень из пятимиллиметрового шприца, гомогенизируйте органы механически при комнатной температуре в течение примерно двух-трех минут, пока одноклеточная подвеска не образуется, и перенесите его в снующий крио флакон. Поместите трубку сразу на сухой лед.
Сделать GC агар пластины с антибиотиками и высушить их до использования при 37 градусов по Цельсию в течение двух-трех часов. Приготовьте 10 полных серийных разбавлений образцов в GC Broth из каждой однородной ткани. Плита их на GC агар пластин и инкубировать на ночь при 37 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа.
С 70%этанола, дезинфицировать голову усыпанной мыши. Используя небольшие хирургические ножницы и стальные типсы с тонкой наконечником, отцейте мех и кожу удаленной головы, затем пройди к верхней части черепа, чтобы четко увидеть швы и направить отверстие черепа. Чтобы открыть череп, вставьте кончик крошечных ножниц через foramen magnum.
Вырезать к центру черепа и через середину теменной кости на противоположную сторону черепа и осторожно сократить вдоль боковой конечности шва ягненка. Используя мелконаводные типсы, начиная с заднего теменной угла, поднимите череп и потяните его по диагонали вверх, чтобы обнаружить мозг, убедившись, что ткань мозга не прикреплена к любой кости головы, когда череп поднимается. Используйте одноразовые типсы для удаления соединительной ткани между черепом и мозгом и не позволяйте ткани мозга высохнуть.
Используйте одноразовые типсы, чтобы немедленно поместить мозг в чашку Петри с одним миллилитром бульона GC, дополненного 10%глицеролом. Используйте поршень из пяти миллилитров шприца для гомогенизации мозга механически при комнатной температуре в течение примерно двух-трех минут, пока одноклеточная подвеска не образуется. Перенесите суспензию в 2 миллилитровую стерильную трубку и храните при 80 градусах цельсия для более поздней оценки жизнеспособных бактериальных клеток.
Оценивалась выживаемость мышей, инфицированных штаммами 93/4286 дикого типа или CSSA дефектных штаммов Neisseria meningitidis. Средняя смертельная доза штамма дикого типа соответствовала менингококковой проблеме от 10 до 4-го CFU. В то время как уровень смертности от 10 до 5 CFU был равен 83,4% и 100%с 10 до 5-й дозы CFU.
Для того, чтобы получить среднюю смертельную дозу для cssA дефектных мутант штамма, доза от 10 до 8 CFU было необходимо и количество 1000 раз выше, чем штамм дикого типа. После инъекции, было быстрое увеличение диких бактерий типа в тканях мозга достигает пика около 24 часов после заражения. В мозге мышей, инфицированных штаммом мутантов, жизнеспособные подсчеты постепенно снизились с течением времени.
Кроме того, 33,3% инфицированных мышей-мутантов показали бактериальный клиренс с места инфекции, в отличие от диких животных. Через 48 часов после заражения дефектный мутант CSSA был полностью очищен в селезенке и печени, в то время как животные, инфицированные штаммом дикого типа, продемонстрировали постоянную инфекцию. Описанный экспериментальный метод может быть полезен для анализа повреждений головного мозга, связанных с этим смертельным заболеванием, путем его патологической оценки, таких как иммуногистохимия, иммунофлуоресценция и анализ мозговых кровотечений.
