פרוטוקול זה מאפשר אפנון בו זמנית של מיקרו RNAs רבים בתאים אוקריוטיים ומבוסס על שיטה פשוטה וגמישה מאוד הממזערת את שלבי השיבוט המולקולרי. טכניקה זו יש השלכות על המחקר של אינטראקציות פונקציונליות מיקרו RNA במבחנה, אבל יותר חשוב זה מספק פלטפורמה לשימוש יעיל יותר של מיקרו RNAs בטיפול. פיתחנו והשתמשנו בו בעיקר בהקשר של סרטן המוח, אבל זה חל על כל המחלות שבהן מעורבים שינויים מרובים של ביטוי גנים.
בדקנו את הגנים הטרנסיים המלאכותיים שלנו במודלים אחרים כגון קווי סרטן השד ובלוטת התריס המראים את הרבייה של טכניקה זו. ידע בסיסי בביואינפורמטיקה וביולוגיה מיקרו-רנ"א מועיל לפרוטוקול זה, אך אינו הכרחי. גישה ביואינפורמטית חשובה כדי להגדיר שילובי מיקרו RNA רלוונטיים ואת TRK-11, בעוד היכרות עם עיבוד מיקרו RNA מדיד חשוב להבין כיצד אלה מיקרו RNAs שונים ניתן להרכיב לתוך אשכולות DNA מלאכותיים שניתן לעבד בהצלחה פעם אחת יציב לתאים הספציפיים.
כדי לצפות את המנה, ראשית להמיס פולי-D-ליסין במים בריכוז של 100 מיקרוגרם למיליליטר. יוצקים את הפתרון לתוך המנה בכמות של מיליליטר אחד של פתרון לכל 25 ס"מ רבועים פני השטח. מערבלים את המנה כדי לוודא כיסוי של המנה כולה.
לאחר שש שעות שאפו את תותב הפולי-די-ליזין ושטוף פעמיים עם PBS. תאי גזע עצביים אנושיים בכמות של 100, 000 תאים לכל חמישה מיליליטר של המדיום, או בתאי גזע בינוניים, מדיום בידול אסטרוציטי או מדיום בידול עצבי. לאחר ציפוי התא, מניחים את המנה באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוז פחמן דו חמצני במשך שבוע ולהמשיך לבצע ניתוח ביטוי מיקרו RNA על פי כתב היד.
לתרבות GBM-34 תאים דמויי גזע גליובלסטומה, להתחיל עם אחד 10 לתאים החמישי וחמישה מיליליטר של מדיום נוירובסאלי בבקבוקון חיבור נמוך 25 ס"מ מרובע. מניחים את הבקבוק באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס וחמישה אחוזים פחמן דו חמצני. 48 שעות לאחר ציפוי, להוסיף הכפלת ריכוזים של DNA alkylating סוכן temozolomide כל שבעה ימים.
התחל עם תוספת של חמישה micromolar TMZ בתוספת בינוני חמישה מיליליטר במשך חמישה ימים. לאחר חמישה ימים, להסיר את המדיום ולהחליף עם מדיום טרי ללא temozolomide כדי לאפשר לתאים ששרדו להתאושש. לאחר 48 שעות, מוסיפים 10 טמוזלומיד מיקרומולאריים ודגירה במשך חמישה ימים נוספים.
חזור על הטיפול temozolomide הכפלה עד ריכוז של לפחות 100 micromolar הוא הגיע ותאים להיות עמידים לתרופה. לאחר אינדוקציה של התנגדות, לשקר תאים באמצעות 1 מיליליטר של ליסיס reagent. לחלץ RNA הכולל ולנתח את הביטוי של RNAs מיקרו ספציפי על פי כתב היד.
כדי להשיג את היעד החזוי של כל מיקרו RNA שהוגדר בעבר, השתמש בכלי חיזוי מיקוד מיקרו RNA. מהעמוד הראשון של TargetScan, בחר את המיקרו רנ"א המעניין מהתפריט הנפתח המאוכלס מראש. לחץ על לחצן שלח.
הורד את רשימת היעדים המתקבלת כגיליון אלקטרוני באמצעות הקישור לטבלת ההורדות. כדי להקטין את הסיכויים לתחזיות חיוביות שגויות, כלול רק יעדים בתוך העמודה אתרים שמורים וניתוח במורד הזרם. תוכניות חיזוי מיקרו-רנ"א נוספות מקבלות מחמירות נוספות וכוללות רק יעדים המשותפים לכל האלגוריתמים.
לאחר מכן, פתח את סוויטת ToppGene 20. כדי להעריך להעשרת מסלולים המשותפים לכל מיקרו רנ"א, הדבק את רשימת המטרות המתקבלות בחלון ערכות הגנים המתאמן. לחץ על סמל HGNC כסוג הערך.
לחץ על שלח והתחל. התוכנית מספקת טבלת פלט המציגה את קטגוריות GO המשמעותיות ביותר עבור רשימת הגנים שהוזנה. כדי לבסס סוף סוף את התרומה של כל מיקרו רנ"א לוויסות של מסלול משותף או תהליך תאי, פתח את פונקציית דיאגרמת ה- venn המסופקת באתר הביואינפורמטיקה והגנומיקה האבולוציונית.
בדוק כל יעד שהושג מול הרשימה המלאה של הגנים המעורבים בתהליך התאי הספציפי. אם RNAs שליח היעד עבור כל RNAs מיקרו של עניין נמצאים בחלונות המתאימים, להעלות של העתק-להדביק את הרשימה. תן שם לכל רשימה עם מזהה ייחודי.
לחץ על שלח. התוכנית מספקת פלט חזותי של דיאגרמת חיתוך קבוצות עם מספר גנים בכל מגזר, כמו גם רשימה מלאה של RNAs שליח עבור כל קבוצת משנה ושילובי הצטלבות. כדי לקבץ את המיקרו-RNAs שנבחרו לגן טרנס פונקציונלי, השג פיגום מהופנט המבוסס על לוקוס האשכול miR-17-92.
השג את רצף הנוקלאוטיד מדפדפן הגנום ההרכב. בחר את רצף הליבה של 800 זוג הבסיסים המקיף את כל ששת סיכות השיער המיקרו-רנ"א המקודדות של הלוקוס ולפחות 200 רצפי אגף נוקלאוטידים הן במעלה הזרם והן במורד הזרם של רצף הליבה. הדבק את הרצף בכל תוכנית לעריכת מילים.
הגדר את הרצף של כל אחד מששת סיכות השיער המקוריות על-ידי אחזורן בבסיס miR. סמן כל אחד מהרצפים האלה בטווח של רצף ליבה שזוהה בעבר. כל הרצפים בין כל סיכת ראש מייצגים רצפי רווחים.
לאחר מכן, להשיג את רצפי סיכת ראש של מיקרו RNAs שנועדו להיות מעל לידי ביטוי בגן טרנס מבסיס miR. שימו לב היטב לנוקלאוטידים הספציפיים שבאתרים של מחשוף מעבד מיקרו. מחק את רצפי סיכות הראש המקוריים מרצף הליבה למעט שלושה עד חמישה נוקלאוטידים הן בחמשת הקצוות והן בקצוות של כל סיכת ראש אשר ישמשו כמקבל עבור סיכות הראש החדשות.
הדבק את רצפי סיכות הראש של המיקרו RNAs הרצויים כדי להחליף את סיכות הראש שנמחקו בעבר. הוסף רצפי הגבלה רצויים בשני אזורי האגף של הגן הטרנסי כדי להקל על שיבוט משנה לווקטורים של מסירה לפי בחירה. ודא כי רצפי ההגבלה שנבחרו אינם קיימים בתוך הרצף עצמו.
כדי לאמת את המבנה הדו מימדי של הגן הטרנס, העתק את הרצף המהונדס המלא לתוך RNA מבנה מבנה תוכנה RNA Webfold. בחר הגדרות תוכנית רגילות ולחץ על המשך. לנתח את הפלט הגרפי, במיוחד עבור נוכחות של סיכות שיער מוגדרות היטב בנוכחות מבני גזע תקועים כפולים כי הם לפחות 11 נוקלאוטידים proximal לאתר מחשוף מעבד מיקרו.
כמו כן, חפשו את היעדר נקודות הסתעפות בתוך רצפי סיכות הראש. בשלב זה, הגן הטרנסי מוכן להיות מיוצר על ידי סינתזת גנים ומשכפל לווקטורים הרצויים. שיטה זו אפשרה אפיון של מודול של שלושה מיקרו RNAs כי הם באופן עקבי למטה מוסדר בגידולים במוח, אשר באים לידי ביטוי במיוחד במהלך בידול עצבי.
דפוסי ביטוי שותף של מודולי מיקרו רנ"א במהלך הלחץ הגנוטוקסי אושרו והציעו פעילות סינרגטית חזקה בין שלושת המיקרו RNAs האלה. הגן הטרנסי המעוצב יכול בו זמנית לסכם את הביטוי של שלושת המיקרו RNAs בתאי גליובלסטומה, הן במבחנה והן במבחנה, עם הפרעה משמעותית בביולוגיה של הגידול והבטחת יכולת תרגום. בנוסף, האשכול הטרנסגני היה גם פונקציונלי במודל סרטן השד.
הדרישות הקריטיות של פרוטוקול זה הן שמירה על הגודל המקורי של מחשוף המעבד בגן הטרנס. וודאו שמבנה לולאת הגזע של סיכות ראש מיקרו רנ"א כימריות נשמר. בשיטה זו, אנו יכולים לרכז מספר רב של גנים מיקרו RNA פעיל ביולוגית לתוך רצפי DNA קצרים מאוד אשר יכול ממש להיות מותאם באופן מוחץ לתוך כל וקטורים משלוח לשימוש ריפוי גנטי.
שיטה זו היא אידיאלית כדי ללמוד את האינטראקציה הפונקציונלית בין מיקרו RNAs שונים להפריע מסלולים סלולריים multifactorial מורכבים אשר אחרת ידרוש שילובי תרופות מרובים.
