שיטה זו מאפשרת לכידת מיקרוגליה בלתי משוחדת ברמת תא יחיד, אשר יכולה לעזור להבהיר את ההטרוגניות המולקולרית של microglia במוח בריא וחולה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מספקת הליך מפורט לבידוד מהיר של microglia מאזורי מוח שונים ומראה כיצד ליצור ביעילות בסיס לשחק את ספריות RA6 תא יחיד עבור רצף עמוק. כדי להתחיל בהליך זה, הכינו את כל המאגרים והפתרונות הדרושים כמתואר בפרוטוקול הטקסט וצננים אותם על הקרח.
לאחר המתת דם ועירת ראשו של העכבר, השתמש במספריים קטנים כדי לחתוך את העור על הראש כדי לחשוף את הגולגולת שמתחת. לאחר מכן, חותכים דרך התפר sagittal, תפר lambdoidal, ותפר קורונאלי. השתמש מטליות כדי למשוך את שני הצדדים של עצםקודית ועצם interparietal מבלי לפגוע ברקמה בזהירות להעביר את המוח לתוך צלחת פטרי ניתוח המכיל בינוני A.באמצעות להב מקורר מראש, לחתוך את המוח דרך קו האמצע לשתי ההמיספרות.
השתמש במלקחיים מספר 55 כדי להפריד את המוח הקטן מהאונה הקורטית וגזע המוח. לאחר מכן, השתמש במספר 55 מדפים כדי לנתח בזהירות את ההיפוקמפוס ואת הסטריאטום מקליפת המוח ולהעביר כל רקמה לתוך אוסף נפרד צלחת פטרי. ראשית, השתמש בסכין גילוח כדי לקצוץ כל אזור במוח לחתיכות עדין שהם פחות ממילימטר מעוקב אחד.
באמצעות פיפיטר אחד מיליליטר עם קצה מנותק, להעביר את חתיכות הרקמה לתוך homogenizers Dounce מקורר מראש. הומוגניזציה של הרקמה על ידי פיתול איטי של הבוכנה פנימה ומבחוץ של homogenizer Dounce במשך שש עד 10 משיכות מלאות עד שלא קיימים גושים גלויים. לאחר מכן, להעביר את הרקמות ניתוב לתוך צינורות 50 מיליליטר דרך מסנני מיקרומטר 70.
לשטוף כל homogenizer Dounce ובוכנה עם סך של שישה מיליליטר של מדיום קר A ואז להעביר את שטיפה לצינור 15 מיליליטר עבור צנטריפוגה. השעיה חד-תאית צנטריפוגית ב 400 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות עם הפסקה בחמש. שטפו עמודת דלדול אחת גדולה ושלוש עמודות בחירה גדולות במפריד מגנטי עם שלושה מיליליטר של MCS.
כאשר הצנטריפוגה עבור דגימות הרקמה הושלמה, פיפטה החוצה להשליך על טבעי מבלי להפריע גלולה. תן שימוש חוזר בתאים במאגר MCS המכיל מעכבי RNase. הוסף 100 microliters של בחנורי הסרת המילין לכל צינור המכיל תאים מושעים מחדש מן קליפת המוח והקטנה ולהוסיף 50 microliters של בחנורי הסרת המילין לכל אחד הצינורות המכילים תאים מושעים מחדש מן ההיפוקמפוס וסטריאטום.
דגירה הצינורות על קרח במשך 10 דקות. לאחר מכן, להוסיף MCS לצינור המכיל תאים קליפת המוח כדי להביא את עוצמת הקול שלה עד שני מיליליטר ואת הצינורות הנותרים להביא כל אחד הכרכים שלהם עד מיליליטר אחד. לאחר שהעמודות ריקות ממאגר שטיפה, טען שני מיליליטר של תאי קליפת המוח אל עמודת הדלדול הגדולה ומיליליטר אחד של מתלה התא השני על עמודות בחירה גדולות נפרדות.
לאחר מכן, לשטוף את עמודי דלדול גדול אלה עם מיליליטר אחד של מאגר MCS ולשטוף כל עמודת בחירה גדולה פעמיים באמצעות מיליליטר אחד של מאגר MCS עבור כל לשטוף. סנן את התאים דרך 35 כובעי מסנני מיקרוליטר לצינורות FACS עגולים. צנטריפוגה צינורות אלה ב 400 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי גלולה את התאים.
לאחר מכן, לשפוך לאט את העל טבעי לטבול את קצה הצינור על נייר טישו. תן שימוש חוזר בתאים בכל צינור עם 300 מיקרוליטרים של מאגר FACS. ראשית, להוסיף חמישה microliters של קולטני FC העכבר לחסום reagent לכל צינור.
דגירה על קרח במשך חמש דקות. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של CD45 PE בגודל שבע ומיקרוליטר אחד של CD11B BV421 לכל צינור. דגירה הצינורות על שייקר בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של מאגר FACS לשטוף. צנטריפוגה ב 400 פעמים g וב ארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי גלולה את התאים. תן שימוש חוזר בתאים בכל צינור עם 400 מיקרוליטרים של מאגר FACS המכיל מיקרוליטר אחד של מעכבי RNase ו-0.5 מיקרוליטרים של פרופידיום יודיד.
בהתאם להליך FACS הסטנדרטי, מיין microglia חי יחיד עם חריר 100 מיקרומטר לתוך לוחות PCR 96 היטב המכילים ארבעה microliters של מאגר תיזה בכל באר. בקצרה מערבולת הצלחות ולסובב אותם למטה באמצעות צנטריפוגה העליון ספסל. לאחסן את הצלחות במינוס 80 מעלות צלזיוס עד הכנת הספרייה.
כאשר מוכן להמשיך, להפשיר את הצלחת על קרח. השתמש במחזור תרמי כדי לבצע שעתוק ראשון כדי ליצור cDNA ולהעצים את cDNA עם שלב עיכול exonuclease נוסף כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, לטהר את cDNA על ידי הוספת 18 microliters של חרוזים מגנטיים לכל באר.
דגירה הצלחת על מעמד מגנטי במשך חמש דקות. לאחר מכן, להסיר את supernatant ולשטוף את הדגימות פעמיים עם טרי עשה 80%אתנול באמצעות 80 microliters של אתנול לגם עבור כל לשטוף. כדי לבצע תג, השתמש במכונת צינור ננוליטר כדי לערבב 0.4 microliters של כל מדגם cDNA עם 1.2 microliters של Tn5 reagents תג מערכת ההכנה הספרייה בצלחת 384 גם ב 55 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
כדי לעצור את תגובת התגיות, הוסיפו 0.4 מיקרוליטרים של חיץ נטרול בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. לאחר מכן, ב 384 אינדקסים ו 1.2 microliters של PCR מעורבב לדגימות להגביר את הספריות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. בריכת כל הספריות בודדות מאותו לוח 384 באר יחד ולהשתמש חרוזים מגנטיים כדי לטהר את הספריות מאגר הסופי.
במחקר זה, microglia מבודדים קליפת המוח, המוח הקטן, ההיפוקמפוס, וסטריאטום של חצי הכדור המוח של עכבר בוגר. ההשעיה התא מוכן נבדק תחת מיקרוסקופ באמצעות כחול trypan ו hemocytometer כדי להעריך את התשואה, הכדאיות התא, ואת היעילות של הסרת המילין לפני ביצוע כתמי נוגדנים. סה"כ ספירת תאים בשלב זה צריכה להיות מעל 30, 000 עבור קליפת המוח ו מעל 5, 000 עבור הרקמות האחרות.
מעל 90% מהתאים צריכים להיות בני קיימא עם פסולת מילין קטנה. מחשב FACS משמש למיון המיקרוגליה, שהם בדרך כלל CD45 נמוך ו- CD11B חיובי. בידוד מוצלח אמור לייצר מעל 80%microglia מתוך כל תאים בודדים חיים, לפחות עבור רקמת קליפת המוח.
לאחר microglia בודדים נלכדים לתוך מאגר תיזה, RNA הוא שוחרר ולאחר מכן הפוך מתמלל cDNA, אשר לאחר מכן מוגברת במשך 23 מחזורים. כפלטפורמת אלקטרופורזה נימית, מנתח השברים וערכות שברי NGS רגישות במיוחד מספקים מידע מהיר ומדויק על התפלגות הגודל, כמו גם כמות מולקולות cDNA הקיימות בכל באר של צלחת 96 באר. ניתן להשתמש בדגימות המציגות מריחה בין 500 ל- 5,000 זוגות בסיסים והן נמצאות מעל סף ריכוז מסוים כדי ליצור ספריות.
הדגימות רצפים לעומק של יותר ממיליון קריאות גולמיות לכל תא, אשר מרווה את כוח הזיהוי של מתודולוגיית ריצוף RNA של תא יחיד. עם קצב מיפוי של כ 60% מעל 2, 000 גנים ניתן לזהות לכל תא microglial. נתונים שפורסמו בעבר שנוצרו משיטת בידוד זו משוחזרים מניסויים עצמאיים, המדגימים את הרגישות לגילוי גנים ספציפיים למיקרוגליה על פני האוכלוסייה הרציפה.
עם המידע של תמלול microglia יחיד, החוקרים יכולים לגלות את אוכלוסיות התאים הייחודיות בהקשר של העניין שלהם, וללמוד עוד יותר את הרלוונטיות התפקודית של אוכלוסיות אלה שזוהו לאחרונה.
