אנו מודים ד ר קלייר דיוויס, ד ר ורוניק מירון (של המלכה Medical Research Institute, אדינבורו, נמצאת בליבה יונייטד) על דיונים הגישה ניסיוני ואת QMRI Flow Cytometry התא מיון מתקן ועזרה ראשונית. עבודה זו נתמכה על ידי סרטן מחקר בבריטניה הקריירה הממסד פרס כדי ד ר דרק Sieger.

1. מדגם והכנות מדיה
<ol><li>להכין העובר בינוני (E3) על ידי המסת 6.4 מ מ אשלגן כלורי, 0.22 מ מ NaCl, מ"מ 0.33 CaCl2 2 H2O, 0.33 מ מ MgSO4 7 שעות2O H2O.</li>
	<li>לאסוף דג זברה העוברים מיד לאחר ההפריה (0 dpf).<ol>
<li>פצל דג זברה עוברי 50 90 מ מ צלחת פטרי. העלאת עוברי ב 28.5 ° C ב- 50 מ של העובר בינוני (E3) שטופלו מיקרומטר 200 1-phenyl 2-thiourea (פרופילתיואוראציל), בסוף היום הראשון של פיתוח (0 dpf) משך זמן הניסוי כדי לעכב פיגמנטציה.</li>
		<li>שינוי E3 + פרופילתיואוראציל בינוני מדי יום משך זמן הניסוי.</li>
		<li>מסך mpeg1:eGFP וזחלים NBT:DsRed-dpf 2 באמצעות stereomicroscope נמכרות עבור ביטוי חיובי transgene, המקרופאגים GFP+ /מיקרוגלייה DsRed+ נוירונים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להכין כל המדיה יום לפני הניסוי ברדס תרביות רקמה כדי למנוע זיהום, ולאחר מכן לאחסן אותם ב 4 º C.<ol>
<li>להכין מדיה A על ידי המסת 15 מ מ Hepes ו- 25 מ מ D-גלוקוז HBSS 1 x.</li>
		<li>הכן דחיסות צבע בינונית (100%) על ידי ערבוב 9 כרכים של המדיום הדרגתיות צפיפות 1 ףקיהב HBSS 10 x.</li>
		<li>הכן המדיום הדרגתיות צפיפות (22 אחוז) על ידי דילול 22 מ של דחיסות צבע בינונית (100%) ב- 88 מ של DPBS 1 x.</li>
		<li>להכין DPBS 1 x.</li>
		<li>הכן E3 בינוני + Tricaine על ידי ערבוב בינונית E3 עם 450 μM Tricaine.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. המגון
הערה: כל השלבים הינם בביצוע 4 ° C.
<ol><li>להוסיף 1.5 mL Tricaine (15 מ מ) ל- 90 מ מ פטרי המכילות הזחלים 50 ב 50 מ של E3 העובר בינוני שטופלו 200 מיקרומטר פרופילתיואוראציל כדי סופני עזים ומתנגד להם.<ol>
<li>להתחנף 10 הזחלים מרדימים צלחות פטרי עם 3 מ ל פסטר פלסטיק בתפזורת פיפטה.</li>
		<li>העברת ומורדמת הזחלים 10 ב-10 לתוך צלחת פטרי 55-מ מ מלא קפואים E3 העובר בינוני + Tricaine.</li>
		<li>תחת stereomicroscope, ישר הזחלים 10 במרכז הפטרי. ואז transect ראשים זחל מעל שק החלמון באמצעות מיקרו-מספריים כירורגיים (לא לכלול שלפוחית אוויר כדי למנוע הצפה ראשי).</li>
		<li>לספוג את ראשיכם צלחות פטרי עם 3 מ ל פסטר פלסטיק בתפזורת פיפטה. לחכות עד כל ראשי מתאספים בעוד קצהו פיפטה ולאחר מכן להעביר אותם לתוך מהמגן זכוכית המכיל A Media כקרח 1 מ"ל (העברה באמצעי אחסון מינימלי כדי להפחית את המדיה לדילול ידי E3 + Tricaine). שמור את מהמגן זכוכית על קרח. השתמש מהמגן אחד לכל תנאי הניסוי.</li>
		<li>להחליף כל פטרי קטן המכיל קרח קר E3 + Tricaine חדשה כל 30 דקות כדי להבטיח את חיתוך מתבצע ב- E3 קר + Tricaine בינונית.</li>
		<li>החלף A Media כקרח ב מהמגן זכוכית הפעלת הצבע דוהה. הערה: דילול של המדיה יכול לשנות את הרקמה ראש עקב שינויי טמפרטורה.</li>
		<li>לאחר שנאסף כל ראשי (600 ראשי/תנאי), להסיר את הנפח המרבי של מדיה A מהמגן זכוכית ולהחליף אותו עם 1 מ"ל של טרי א מדיה קר כקרח</li>
		<li>לשבש את רקמת המוח עם מהמגן זכוכית צר על קרח. לבצע סיבובים 40 של ריסוק, והופך את הזחלים dpf 3-5, 50 עבור הזחלים dpf 7 ו- 8.</li>
	</ol>
</li>
	<li>להוסיף 2 מ"ל של מדיה A תא ההשעיה (1 מ"ל מדיה A / 200 ראשי), זה תאים למהול ולהפחית שלהם הצטברות המיאלין כדי להקל על הפירוד שלהם במהלך צנטריפוגה דחיסות צבע בינוני.<ol>
<li>כדי למנוע הצטברות תאים, לרוץ התליה תא דרך מסננת תא 40 µm להציב על גבי צינור בז קר 50 מ ל שמר על קרח. חזור על פעולה זו 3 פעמים.</li>
		<li>להעביר 1 מ"ל של השעיה תא קר mL 1.5 צינורות ולסובב אותם ב 300 גרם 10 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>להסיר את תגובת שיקוע באמצעות מזרק 10-mL + מחט 23G x 1''.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מחדש להשעות בגדר תא עם 1 מ"ל כקרח 22% צפיפות צבע בינוני בשכבות בעדינות על ידי 0.5 מ של קרח DPBS 1 x (do לא לערבב אותם, לאטמוספרה בין שני פתרונות יראו).<ol>
<li>ספין צינורות ב 950 g ללא בלימה והאצה איטי למשך 30 דקות ב 4 º C. הערה: שלב זה מפריד את המיאלין של תאים אחרים על-ידי sequestering זה-לאטמוספרה של DPBS 1 x ו- 22% צפיפות בינונית הדרגתיות, ואילו תאים גלולה בתחתית הצינורית. המיאלין הסרת יעיל יותר כאשר התא ריכוז אינו גבוה מדי.</li>
		<li>באמצעות על מזרק 10-mL + מחט 23G x 1'' להשליך המרבי של DPBS, צפיפות בינונית הדרגתיות המיאלין לכוד ב שלהם לאטמוספרה.</li>
		<li>לשטוף תאים עם 0.5 מ"ל של מדיה A + 2% של סרום עז רגילה (הגדרות), ואז לסובב צינורות-300 גרם 10 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>למחוק את המקסימום של תגובת שיקוע ולאחר מכן מאגר כל כדורי תא לפי מצב ניסיוני באותו יחד 1 מ"ל של מדיה A + 2% המיתרים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>אם התאים של ריבית מבטאים חלבון פלואורסצנטי כמו מקרופאגים/מיקרוגלייה מ mpeg1:eGFP או נוירונים NBT:DsRed הטרנסגניים דגים (הקרנת לראות דגים הטרנסגניים 1.1.3), לרוץ התליה תא דרך מסננת תא מיקרומטר 35 קאפ ולהעביר אותם לתוך צינורות קר 5 מ"ל FACS בקרח, מוגן מפני אור. הערה: לחלופין, מכתים חיסונית של מיקרוגלייה יכולה להתבצע.</li>
</ol>3. מיקרוגלייה חיסונית מכתים
הערה: כל הצעדים מבוצעים ב 4 º C.
<ol><li>מחדש להשעות בגדר תא עם mL 0.3 של מדיה A + 2% המיתרים. לפצל אותם צינורות 3 x 1.5 mL: אחד עבור תאים וללא רבב למדוד אוטומטי-זריחה מתאי מעניינים, שנית הנוגדן המשני (1/200) למדוד את הכריכה לא ספציפית של הנוגדן משני כדי מיקרוגלייה ושלישית כמבחן (4C 4 העכבר monoclonal נוגדנים (מיקרוגלייה ספציפי) (1/20) + נוגדנים משניים (1/200)).<ol>
<li>הוסף אנדוטוקסין נמוכה, ללא אזיד (עלה)-1% תאים (כל צינורות) כדי לחסום את CD16/CD32 אינטראקציות עם התחום Fc של immunoglobulins. דגירה תאים עבור 10 דקות עם עצבנות עדין כל 5 דקות.</li>
		<li>הוסף את 4 4C נוגדן (1/20) על תאים (צינור 3) דגירה למשך 30 דקות עם עצבנות עדין כל 10 דקות.</li>
		<li>ספין צינורות-300 גרם 10 דקות ב 4 ° C, ואז למחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>לשטוף לאחר 0.5 מ של מדיה A + 2% המיתרים, ואז לסובב צינורות-300 גרם 10 דקות ב 4 º C.</li>
		<li>צניפה תא מחדש להשעות 0.5 מ של מדיה A + 2% המיתרים דגירה תאים עם עלה ב-1% למשך 10 דקות עם עצבנות עדין כל 5 דקות.</li>
		<li>להוסיף נוגדנים משניים (1/200) לתאים (הצינור 2 ו- 3). דגירה תאים למשך 30 דקות עם עצבנות עדין כל 10 דקות והגנה אור.</li>
		<li>ספין צינורות-300 גרם 10 דקות ב 4 ° C, ואז למחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>תשטוף פעמיים עם 0.5 מ של מדיה + 2% המיתרים, בזמנו, מחדש להשעות תא גלולה עם 1 מ"ל של מדיה A + 2% המיתרים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>תריץ תא ההשעיה כובע מסננת 35 מיקרומטר תא ולהעביר אותם אל תוך קר 5 מ"ל FACS צינורות בקרח, מוגן מפני אור.</li>
</ol>4. תא מיון (FACS)
הערה: בצע את כל השלבים ב 4 º C.
<ol><li>למיין נוירונים, מקרופאגים/מיקרוגלייה מיקרוגלייה באמצעות FACS. הערה: שלב זה מתבצע בדרך כלל על ידי איש צוות של המתקן FACS, הגדרות תלויות בסוג ציוד.<ol>
<li>להוסיף דאפי ריכוז של µg/mL 1 ב כל שפופרת FACS לסמן תאים מתים.</li>
		<li>להגדיר את הנוירונים FACS ומיון, מקרופאגים/מיקרוגלייה או מיקרוגלייה מכל התאים במוח. בתאים נפרדים מפני פסולת תפקודה של צפיפות רשת ובגודל שלהם, ואז שער חד-תאים על ידי פיזור קדימה ופיזור בצד. הכללת תאים מתים מאת דאפי labelling מתוך תאים חיים. לזהות נוירונים, מקרופאגים/מיקרוגלייה או מיקרוגלייה מאת שלהם מכתים חיוביות בהתאמה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>איסוף תאים צינורות 1.5 mL המכיל 1 מ"ל של מדיה A + 2% קר כקרח המיתרים על קרח. השתמש צינורות שונים עבור כל סוג התא.<ol>
<li>ספין צינורות-300 גרם 10 דקות ב 4 ° C ולאחר מכן למחוק את תגובת שיקוע.</li>
		<li>לשטוף לאחר 0.5 מ של מדיה אז למחוק את המקסימום של תגובת שיקוע.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. RNA החילוץ
<ol><li>לחלץ RNA סוגי התאים מופרדים על-ידי FACS. לחילוץ RNA להשתמש ערכת ספציפיים, פעל לפי ההנחיות של היצרן. ודא עובד בסביבה RNase חינם על-ידי ניקוי סביבת פיפטות עם מוצר טיהור RNase ולהשתמש מסנן טיפים.<ol>
<li>להכין טרי 1 מ"ל של פירוק מאגר בתוספת 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol. הערה: כאן, β-mercaptoethanol נוספת כדי להפחית את ה-RNA השפלה.</li>
		<li>להכין פתרון אתנול 70% ו- 80% באמצעות RNase מים חינם.</li>
		<li>Lyse תאים עם 75 µL מאגר פירוק בתוספת 50 מיקרומטר β-mercaptoethanol. לאחר מכן להשתמש מגרסה והשמד לשיפור לשבירת תאים.</li>
		<li>המשך במדריך של החילוץ-RNA לפי יצרן.</li>
		<li>בסוף הפרוטוקול, elute את ה-RNA עם 14 µL של מים בחינם RNase בריכוז ה-RNA מספיקות.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chrast, R., Scott, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Mouse+Brain+Transcriptome+by+SAGE:+Differences+in+Gene+Expression+between+P30+Brains+of+the+Partial+Trisomy+16+Mouse+Model+of+Down+Syndrome+(Ts65Dn)+and+Normals.">The Mouse Brain Transcriptome by SAGE: Differences in Gene Expression between P30 Brains of the Partial Trisomy 16 Mouse Model of Down Syndrome (Ts65Dn) and Normals.</a> Genome Research. 10 (12), 2006-2021 (2000).</li><li>Beis, D., Stainier, D. Y. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+cell+biology:+following+the+zebrafish+trend.">In vivo cell biology: following the zebrafish trend.</a> Trends in Cell Biology. 16 (2), 105-112 (2006).</li><li>Shiau, C. E., Kaufman, Z., Meireles, A. M., Talbot, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Requirement+for+irf8+in+Formation+of+Embryonic+and+Adult+Macrophages+in+Zebrafish.">Differential Requirement for irf8 in Formation of Embryonic and Adult Macrophages in Zebrafish.</a> PLoS ONE. 10 (1), 0117513-0117515 (2015).</li><li>Mazaheri, F., Breus, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+roles+for+BAI1+and+TIM-4+in+the+engulfment+of+dying+neurons+by+microglia.">Distinct roles for BAI1 and TIM-4 in the engulfment of dying neurons by microglia.</a> Nature Communications. 5, 1-11 (2014).</li><li>Oosterhof, N., Holtman, I. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+conserved+and+acute+neurodegeneration-specific+microglial+transcriptome+in+the+zebrafish.">Identification of a conserved and acute neurodegeneration-specific microglial transcriptome in the zebrafish.</a> Glia. 65 (1), 138-149 (2016).</li><li>Hamilton, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Zebrafish+Live+Imaging+Model+Reveals+Differential+Responses+of+Microglia+Toward+Glioblastoma+Cells+In+Vivo.">A Zebrafish Live Imaging Model Reveals Differential Responses of Microglia Toward Glioblastoma Cells In Vivo.</a> Zebrafish. , (2016).</li><li>Ellett, F., Pase, L., Hayman, J. W., Andrianopoulos, A., Lieschke, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mpeg1+promoter+transgenes+direct+macrophage-lineage+expression+in+zebrafish.">mpeg1 promoter transgenes direct macrophage-lineage expression in zebrafish.</a> Blood. 117 (4), 49-56 (2011).</li><li>Peri, F., N&#252;sslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+Imaging+of+Neuronal+Degradation+by+Microglia+Reveals+a+Role+for+v0-ATPase+a1+in+Phagosomal+Fusion+In+Vivo.">Live Imaging of Neuronal Degradation by Microglia Reveals a Role for v0-ATPase a1 in Phagosomal Fusion In Vivo.</a> Cell. 133 (5), 916-927 (2008).</li><li>Sieger, D., Moritz, C., Ziegenhals, T., Prykhozhij, S., Peri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-range+Ca2++waves+transmit+brain-damage+signals+to+microglia.">Long-range Ca2+ waves transmit brain-damage signals to microglia.</a> Developmental cell. 22 (6), 1138-1148 (2012).</li><li>Becker, T., Becker, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regenerating+descending+axons+preferentially+reroute+to+the+gray+matter+in+the+presence+of+a+general+macrophage/microglial+reaction+caudal+to+a+spinal+transection+in+adult+zebrafish.">Regenerating descending axons preferentially reroute to the gray matter in the presence of a general macrophage/microglial reaction caudal to a spinal transection in adult zebrafish.</a> The Journal of comparative neurology. 433 (1), 131-147 (2001).</li><li>Ohnmacht, J., Yang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+motor+neurons+are+regenerated+after+mechanical+lesion+and+genetic+ablation+in+larval+zebrafish.">Spinal motor neurons are regenerated after mechanical lesion and genetic ablation in larval zebrafish.</a> Development. 143 (9), 1464-1474 (2016).</li><li>Roy-Carson, S., Natukunda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+transcriptomic+landscape+of+the+developing+enteric+nervous+system+and+its+cellular+environment.">Defining the transcriptomic landscape of the developing enteric nervous system and its cellular environment.</a> BMC Genomics. 18 (1), 1-24 (2017).</li><li>Khuansuwan, S., Gamse, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+differentially+expressed+genes+during+development+of+the+zebrafish+pineal+complex+using+RNA+sequencing.">Identification of differentially expressed genes during development of the zebrafish pineal complex using RNA sequencing.</a> Developmental biology. 395 (1), 144-153 (2014).</li><li>Schmid, C. D., Melchior, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+gene+expression+in+LPS/IFN&#947;+activated+microglia+and+macrophages:+in+vitroversus+in+vivo.">Differential gene expression in LPS/IFN&#947; activated microglia and macrophages: in vitroversus in vivo.</a> Journal of Neurochemistry. 109, 117-125 (2009).</li><li>Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Tucker, A. F., Collins, H. Y., Mulinyawe, S. B., Barres, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Requirements+for+Microglial+Survival,+Specification,+and+Function+Revealed+by+Defined-+Medium+Cultures.">Diverse Requirements for Microglial Survival, Specification, and Function Revealed by Defined- Medium Cultures.</a> Neuron. 94 (4), 759-773 (2017).</li><li>Khan, A., Ju, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptomic+analysis+reveals+differential+activation+of+microglial+genes+after+ischemic+stroke+in+mice.">Transcriptomic analysis reveals differential activation of microglial genes after ischemic stroke in mice.</a> Neuroscience. 348, 212-227 (2017).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול נסיוני המתוארים כאן מייצג שיטה חזקה ויעילה כדי לבודד תאי מוח של דג זברה הזחלים 3 כדי 8 dpf. חשוב, זה הפרוטוקול הראשון המאפשר הבידוד ספציפי של מיקרוגלייה מן המוח דג זברה זחל. הפרוטוקול נועד כדי לשמר את שלמות קרום התא כדי למזער את השינויים פוטנציאלי של ביטוי גנים שאירעו במהלך העיבוד. הנקודה האחרונה חיונית הרלוונטיות של תוצאות בהתבסס על הניתוח של פרופילים מבודדים אלה גנומית הסלולר. אכן, קיטוב מיקרוגלייה ו מקרופאג חריפה מושפעים microenvironment שלהם. ב 37 מעלות צלזיוס, תאים אלה הייתי משנה שלהם פרופיל ביטוי גנטי בתגובה לתנאי הניסוי (פציעה (חיתוך) תגובה). לכן, זה היה חיוני לבצע את הניסוי הזה ב 4 ° C לפני החילוץ RNA, להאט תהליכים תאיים ופעילויות מטבולית. יתר על כן, המגון רקמת המוח מכני ב 4 ° C נבחר במקום עיכול אנזימטי רקמות ב 37 ° C כדי למנוע כל השפעה על ביטוי גנים פרופילים.
חשוב להדגיש כי שיטה זו היא מהירה מאוד; תוך יום מספר אוכלוסיות של תאי המוח יכול להיות מבודד לפחות שני תנאים ניסויים שונים ו- RNA שלהם שחולצו. האורך הכולל של הפרוטוקול תלוי המספר של הזחלים משמש עבור כל תנאי חיתוך של ראשי הזחל הוא הצעד המגביל (∼ 350 ראשי/h). באופן כללי, כדי לעבוד עם מיקרוגלייה 3, 5 ו-7 dpf מומלץ transect ∼ ראשי 600 לכל מבחן כדי לקבל מספיק RNA לחלץ (טבלה 1). מיקרוגלייה מייצגים את סוג התא עם הנמוך ביותר תשואה (כ – 112 תאים לכל ראש-7 dpf), ניתן לצמצם את מספר ראשי עבור סוגי תאים אחרים כולל מקרופאגים (כ – 170 תאים לכל ראש-7 dpf).
יתרון נוסף של פרוטוקול זה הוא כי ברגע הגדרות ב סדרן FACS הוקמו, באותן ההגדרות יכול לשמש לניסויים שונים. נצפתה כי אוכלוסיות תאים מתאימים באופן מושלם מהניסוי אחד אחר עם שערים תוכנן בעבר, מציג את הפארמצבטית הניסויים בשיטה זו.
חיסרון קל של שיטה זו הוא כמות נמוכה יחסית של RNA האיסוף. אולם, מגבלה זו היא יותר עניין ביולוגי מאשר בעיה טכנית, כמו מספר מיקרוגלייה נמוכה מאוד בשלבים המוקדמים של התפתחות המוח (טבלה 1). בגלל זה כמות נמוכה של RNA שנאספו, הגברה צעדים שצריך לקחת בחשבון כדי לבצע ניתוח ביטוי גנטי רחב הגנום. למרבה המזל, השלבים הגברה לייצר כמויות מספיקות של cDNA באיכות גבוהה. לפיכך, שינויים כלליים של ביטוי גנים פרופילים של תאים מבודדים ניתן יהיה ללמוד.
לסיכום, פרוטוקול זה מספק שיטה חזקה לבודד וללמוד סוגים שונים של תאים CNS מן המוח דג זברה זחל. זה ניתן להחיל כדי לרכוש הבנה מעמיקה יותר של תאים אלה במהלך הפיתוח גם כדי ללמוד את התפקיד שלהם למחלה.

ידע על התפתחות המוח, המוח מחלות השתפרה במידה ניכרת בעשור האחרון מאז כימות הראשון של העכבר-המוח-transcriptomes-1. אכן, ניתוח ביטוי גנטי רחב הגנום נותן לנו גישה למידע גנטי מפורט על רקמת המוח ותאי זה יכול להשלים ולשפר את תצפיותיו עם טכניקות וכלים אחרים.
דג זברה היא דוגמנית ביולוגי חזק, קל להתרבות וכדי לשנות גנטית; שקיפותו אופטי בשעה שדרגות מאפשרת חיים תצפיות הדמיה2. למרבה הצער, בהשוואה ל אנושי, עכבר, המספר של נוגדנים זמינים לביצוע מכתים חיסונית נמוכות למדי. כדי לתקן זאת, קווים דגים דג זברה מהונדס בקלות מתבצעים על-ידי שינוי גנטית דג אקספרס חלבונים פלורסנט תחת התא סוג ספציפי היזמים. דג זברה מהונדס קווים שימשו בעבר ללמוד את התפקיד של מקרופאגים מיקרוגלייה בזמן מחלה3,4,5,6ופיתוח של מערכת העצבים המרכזית (CNS). עם זאת, כדי להשיג הבנה מפורטת של תהליכים אלה אנחנו צריכים להבין שינויים בביטוי הגנים סוגי תאים המתאימים. לכוונה זו, פיתחנו שיטה ניסיונית במיוחד בידוד תאי כמו נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה 3 8 ימים לאחר ההפריה (dpf) זחל דג זברה המוח. להקמתה של הפרוטוקול, עבדנו עם קווים דגים הטרנסגניים המבטאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ב מקרופאגים/מיקרוגלייה תחת הגן בא לידי-ביטוי מקרופאג יזם (mpeg1:eGFP) ו- DsRed בנוירונים תחת ß-טובולין עצבית יזם (NBT:DsRed)7,8,9. יתר על כן, ביצענו מכתים חיסונית של מיקרוגלייה באמצעות 4C 4, נוגדן חד שבטי העכבר זה במיוחד כתמי דג זברה מיקרוגלייה10,11. לאחר מכן, חומצה ריבונוקלאית (RNA) מופק מן התאים האלה עוד יותר כמותיים תגובת שרשרת פולימראזית (qPCR) או transcriptome ניתוחים. פרוטוקול זה תוכנן כדי homogenize ביעילות רקמת מוח של דג זברה הזחלים; לאסוף את הנוירונים, מקרופאגים/מיקרוגלייה מיקרוגלייה ללא שינוי של שלמות קרום פלזמה שלהם ולחלץ סוף סוף RNA של תאים אלה באיכות גבוהה (RIN > 7) וכמות לבצע אנליזה גנומית. בניגוד מחקרים שפורסמו בעבר להשתמש טריפסין טיפול ב 37 מעלות צלזיוס לעכל12,של רקמת המוח13, פרוטוקול זה מקדם את העבודה ב 4 ° C עד השלב החילוץ RNA כדי להפחית את השינויים של פרופיל ביטוי גנטי. שלב זה הוא קריטי כמו מיקרוגלייה ו מקרופאגים הם תאים רגישים אשר מגיבים לשינויים microenvironment שלהם מיד על ידי שינוי שלהם ג'ין ביטוי פרופיל של קיטוב14,15, 16.
הפרוטוקול, המתוארים כאן בפירוט, מראה שהבידוד של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן מוח זחל דג זברה, אך למעשה, זה ניתן להתאים לכל תא אחר להציג בתוך המוח - גם באמצעות דגים הטרנסגניים שורות או בלוחיות הסבר נוגדנים ספציפיים. שיטה זו יאפשר אפיון טוב יותר של תאי מערכת העצבים המרכזית דרך את בדיקותיהם ביטוי הגן רחב של הגנום, תסייע לך להבין את תפקידם במהלך התפתחות המוח מחלות.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:840px;" width="840">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">1-phenyl 2-thiourea (PTU)</td>
			<td style="width:319px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">P7629</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Hepes</td>
			<td style="width:319px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">15630-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:319px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">G8644-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HBSS 1X</td>
			<td style="width:319px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">14170-088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Percoll</td>
			<td style="width:319px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:103px;">17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">HBSS 10X</td>
			<td style="width:319px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">14180-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DPBS 1X</td>
			<td style="width:319px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">14190-094</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tricaine (MS222)</td>
			<td style="width:319px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">A5040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sterilin standard 90mm petri dishes</td>
			<td style="width:319px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:103px;">101VIRR</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Surgical micro-scissors</td>
			<td style="width:319px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:103px;">15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">3 mL Pasteur plastic bulk pipette</td>
			<td style="width:319px;">SLS</td>
			<td style="width:103px;">PIP4206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Glass homogenizer</td>
			<td style="width:319px;">Wheaton</td>
			<td style="width:103px;">357538</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Sterilin standard 55mm petri dishes</td>
			<td style="width:319px;">ThermoFisher</td>
			<td style="width:103px;">P55V</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Percoll</td>
			<td style="width:319px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:103px;">17-0891-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">40 &#181;m cell strainer</td>
			<td style="width:319px;">Falcon</td>
			<td style="width:103px;">352340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">50 ml polypropylen conical tube</td>
			<td style="width:319px;">Falcon</td>
			<td style="width:103px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:319px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:103px;">5804 R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">10 mL syringe</td>
			<td style="width:319px;">BD</td>
			<td style="width:103px;">302188</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Needle 23G x 1&#39;&#39;</td>
			<td style="width:319px;">BD</td>
			<td style="width:103px;">300800</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Normal goat serum (NGS)</td>
			<td style="width:319px;">Cell Signalling</td>
			<td style="width:103px;">5425S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">35 &#956;m cell strainer cap</td>
			<td style="width:319px;">BD</td>
			<td style="width:103px;">352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">FACS tubes</td>
			<td style="width:319px;">BD</td>
			<td style="width:103px;">352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Low Endotoxin, Azide-Free (LEAF)</td>
			<td style="width:319px;">Biolegend</td>
			<td style="width:103px;">101321</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Alexa Fluor 647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>A11008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Anti-4C4</td>
			<td colspan="2">Courtesy of Catherina Becker (University of Edinburgh)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">FACS sorter FACSAria II</td>
			<td style="width:319px;">BD</td>
			<td colspan="2">QMRI, FACS facility</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNeasy Plus Micro Kit</td>
			<td style="width:319px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:103px;">74034</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">&#946;-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:319px;">Gibco</td>
			<td style="width:103px;">&#160;31350-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">QIAshredder</td>
			<td style="width:319px;">QIAGEN</td>
			<td style="width:103px;">79654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix</td>
			<td style="width:319px;">Bio-Rad</td>
			<td style="width:103px;">1725271</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">SuperScript III First-Strand Synthesis System</td>
			<td style="width:319px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:103px;">18080-051</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:252px;">LightCycler 96 Real-Time PCR System&#160;</td>
			<td style="width:319px;">Roche</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Ovation RNA-Seq System V2</td>
			<td style="width:319px;">NuGEN</td>
			<td style="width:103px;">7102-32</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">Agilent RNA 6000 Pico reagents</td>
			<td style="width:319px;">Agilent</td>
			<td style="width:103px;">5067-1513</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:252px;">2100 Bioanalyzer</td>
			<td style="width:319px;">Agilent</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">RNaseZap</td>
			<td style="width:319px;">Ambion</td>
			<td style="width:103px;">AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation and rna extraction of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains

כדי לקבל הבנה מפורטת של התפקיד של תאים שונים CNS במהלך פיתוח או הקמת והתקדמות של פתולוגיות במוח, חשוב לבודד תאים אלה מבלי לשנות פרופיל ביטוי גנטי. המודל דג זברה מספק מספר רב של קווים דגים מהונדס שבו לוחיות ההסבר סוגי תאים ספציפיים; לדוגמה הנוירונים NBT:DsRed קו או מקרופאגים/מיקרוגלייה בקו mpeg1:eGFP. יתר על כן, פותחו נוגדנים כתם תאים ספציפיים, כגון מיקרוגלייה עם 4C 4 נוגדן.
כאן, אנו מתארים את הבידוד של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח דג זברה זחל. מרכזי פרוטוקול זה הוא ההתרחקות עיכול אנזימטי רקמות ב 37 מעלות צלזיוס, אשר יכול לשנות פרופילים הסלולר. במקום זה משמש מערכת מכנית של רקמות המגון ב 4 ° C. פרוטוקול זה כרוך המגון המוח לתוך התא ההשעיה, מכתים חיסונית שלהם, הבידוד של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מאת FACS. לאחר מכן, אנו מופק RNA תאים אלה, להעריך את האיכות/כמות. הצלחנו להשיג RNA באיכות גבוהה (RNA תקינות מספר (RIN) > 7) כדי לבצע qPCR על ניתוח מקרופאגים/מיקרוגלייה נוירונים, ואת transcriptomic על מיקרוגלייה. גישה זו מאפשרת אפיון טוב יותר של תאים אלה, כמו גם הבנה ברורה יותר על התפקיד שלהם בתחום הפיתוח פתולוגיות.

הפרוטוקול המתואר היא גישה ישירה לבודד את הנוירונים, מאקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה. אלה מבודדים תאים, כמויות משמעותיות של איכות גבוהה (RIN > 7) RNA חולצו. המטרה של פרוטוקול זה נועד לבודד סוגים שונים של תאים של מערכת העצבים, בשינוי מינימלי של שלהם פרופיל ביטוי גנטי לאבחן ולאפיין את מאפייני תא ופונקציות. לכן, פרוטוקול כולו מתבצע ב 4 ° C עם המגון רקמות המוח מכני. שיטה זו שימש בהצלחה במשך שני מחקרים שבוצעו במעבדה. במחקר הראשון, נוירונים ו מקרופאגים/מיקרוגלייה הם בודדו אותנו מהמתרחש 8 dpf mpeg1:eGFP+/NBT:DsRed+ הזחלים (איור 1). FACS מורשה למחקר מפני פסולת תפקודה של גודלם (FSC-A), צפיפות (האס-A) (איור 1א'). תאים בודדים הופרדו אז doublets או תא agglomerates (איור 1B). מן האוכלוסייה תא בודד, שער צוירה לסלק תאים מתים (דאפי+). העלילה נקודה המתאימה חשף כי פרוטוקול נסיוני זה שומר על תאי פלזמה הקרומיות, כמו הקצב של תאים מתים רק 26.7% (איור 1C). לבסוף, נוירונים (DsRed+) ו מקרופאגים/מיקרוגלייה (GFP+) היו בקלות הפרדה בין השערים אוכלוסיית תאים חיים. האוכלוסייה נוירון (23.1%) נראה בולט יותר מאשר באוכלוסיה מקרופאגים/מיקרוגלייה (1.56%) בתוך המוח (איור 1D). פרוטוקול זה אפשרה לבודד RNA של תאים אלה כדי לבצע ניתוח qPCR עוקבות. להשוות את הביטוי של גנים ספציפיים בין הנוירונים מקרופאגים/מיקרוגלייה. איור 2 מופעים עצביים, מקרופאגים/מיקרוגלייה ג'ין רמות הביטוי של מתרבים תאים גרעיניים אנטיגן (pcna)נגד הגן משק בית β-אקטין כדוגמה.
לצורך המחקר השני בשיטה זו התמקדו מיקרוגלייה בידוד מן המוח זחל dpf 3, 5, 7. בניגוד הניסוי המתואר לעיל, התאים היו מבודדים על ידי מכתים חיסונית באמצעות 4C 4, נוגדנים אשר במיוחד תוויות מיקרוגלייה (איור 3 A-D). כאמור תיאר, מיקרוגלייה (4C 4+) נבחרו מתוך תאים חיים ואסף (איור 3ד'). מיקרוגלייה בתוך המוח זחל דג זברה המספרים משתנה (טבלה 1), נמוך מאוד-dpf 3 (∼ 25 לכל דג). האיכות והכמות של RNA שחולצו מן תאים אלה נמדדו באמצעות מערכת אלקטרופורזה מיקרו-נים מבוסס. התוצאות המתקבלות של RNA שחולצו מן מיקרוגלייה 5 מוח של דג זברה זחל dpf סופקו להדגמת של RNA ניתוח (טבלה 1 (5 dpf; ניסוי 4)). איור 4 מציג את האיתור אלקטרופורזה וייצוג גרפי שלו השיג עבור דוגמה זו עם פריט חזותי ברור של ribosomal RNA (28s ו- 18s). נתונים אלה יש צורך לחשב לדוגמה רין וכדי לקבוע ריכוז ה-RNA. טבלה 1 מסכמת מספר מיקרוגלייה מבודד לכל הכמות של RNA לכל מיקרוגלייה ודגים, התוצאה רין השיג עבור ניסוי שונות-dpf 3, 5, 7. הכמות והאיכות של RNA שחולצו מן מיקרוגלייה מבודדים באמצעות שיטה זו אפשר לנו להגביר את הרנ א לתוך cDNA באמצעות ערכת. בדיקות איכות וכמות שסופקו על-ידי אדינבורו גנומיקה לאשר cDNA מוגבר באיכות מספקת עבור ספריית הכנה ורצף עוקבות. איור 5 מציג את התפלגות גודל של קטעי cDNA והכמות שלהם נמדד באמצעות מערכת electrophoretic. במדגם זה, cDNA היה בגודל אכזרי של 299bp-ריכוז 36100 pmol/ל' בטבלה 2 מדגים בהתאמה בדיקות איכות וכמות ב cDNA מוגבר מדגימות RNA (טבלה 1 (5 dpf; ניסוי 4)). CDNA מוגבר שימש בהצלחה עבור רצף.
מספר מחקרים שבוצעו במעבדה אישרו כי האיכות והכמות של RNA שחולצו מן הנוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה יכול לשמש qPCR הבאים וניתוחים ביטוי הגן רחב הגנום. לכן, פרוטוקול נסיוני זה ניתן לבודד אמינה סוגים שונים של תאי מערכת העצבים המרכזית ללא שינוי שלהם הקרומיות והגבלת שינוי של הפרופיל שלהם ביטוי גנים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig1.jpg"> איור 1 : FACS מיון נוירונים ו מקרופאגים/מיקרוגלייה מן mpeg1:GFP+/NBT:DsRed+ 8 dpf דג זברה הזחלים. (א-ג) Gating רצופים מציגה מבחר רציף של תאים כל המוח (א), תאים בודדים על-ידי פיזור קדמי וצד פיזור (B). (ג) מתים התאים היו לא נכלל בשל labelling דאפי. (ד) נוירונים ו מקרופאגים/מיקרוגלייה אותרו בהתאמה על ידי DsRed ו- GFP מכתים חיובי. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig2.jpg"> איור 2 : הביטוי מפענוח pcna ו β-אקטין נוירונים ו מקרופאגים/מיקרוגלייה. יכול להיות עיבד RNA נוירונים בודדים, מקרופאגים/מיקרוגלייה לתוך cDNA לשימוש בניתוח ה-PCR כמותי. mRNA רמות הביטוי של pcna נגד β-אקטין ג'ין משק בית מבודד נוירונים ו מקרופאגים/מיקרוגלייה נקבעים על-ידי qPCR (N = 3). קיפול שינוי נמדדה באמצעות השיטה השוואתי (ΔΔCT). שגיאה בר לייצג זאת אומרת ± ב- SEM <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig3.jpg"> איור 3 : FACS מיון עבור מיקרוגלייה מ 3 dpf דג זברה הזחלים. (א-ג) תאים רצופים המגביל הצג רציפים מבחר כל המוח (א), תאים בודדים על-ידי פיזור קדמי וצד פיזור (B). (ג) מתים התאים היו לא נכלל בשל labelling דאפי. (ד) מיקרוגלייה זוהו על ידי 4C 4 מכתים חיובי. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig4.jpg"> איור 4 : מיקרו-נים תוצאות אלקטרופורזה של RNA שחולצו מן מיקרוגלייה דג זברה dpf 5. שתי הפסגות גבוה הן ribosomal RNA 18S, 28S. RNA תקינות מספר (RIN) היה מחושבים באופן אוטומטי על ידי תוכנת bioanalyzer באמצעות היחס שנוצר את 18S, 28S ribosomal subunits וניתוח של האיתור electrophoretic כולו. מיקרוגלייה RNA יש של 8.6 רין. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57431/57431fig5.jpg"> איור 5 : בדיקות האיכות והכמות של cDNA מוגבר מהדגימה RNA של 5 dpf דג זברה מיקרוגלייה. התמונה מציגה cDNA פרגמנט גודל להתפלגות המדגם שנותחה בגודל אכזרי של 299 bp. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57431/57431fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>תנאי</td>
			<td>ניסוי</td>
			<td>מספר דגים</td>
			<td>מספר הטלפון הנייד</td>
			<td>מספר הטלפון הנייד לכל דג</td>
			<td>ריכוז ה-RNA (pg/ul)</td>
			<td>סה כ RNA (עמוד)</td>
			<td>כמות ה-RNA בכל תא (עמוד)</td>
			<td>רין ניקוד</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>700</td>
			<td>11922</td>
			<td>17.03</td>
			<td>126</td>
			<td>1512</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>22527</td>
			<td>37.55</td>
			<td>253</td>
			<td>3036</td>
			<td>0.13</td>
			<td>7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>18688</td>
			<td>31.15</td>
			<td>255</td>
			<td>3060</td>
			<td>0.16</td>
			<td>7.7</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>11121</td>
			<td>18.54</td>
			<td>189</td>
			<td>2268</td>
			<td>0.20</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>15581</td>
			<td>25.97</td>
			<td>131</td>
			<td>1572</td>
			<td>0.10</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>3dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>11965</td>
			<td>19.94</td>
			<td>256</td>
			<td>3072</td>
			<td>0.26</td>
			<td>8.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>58629</td>
			<td>97.72</td>
			<td>362</td>
			<td>4344</td>
			<td>0.07</td>
			<td>7.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>600</td>
			<td>32510</td>
			<td>54.18</td>
			<td>348</td>
			<td>4176</td>
			<td>0.13</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>77884</td>
			<td>129.81</td>
			<td>594</td>
			<td>7128</td>
			<td>0.09</td>
			<td>8.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>50755</td>
			<td>84.59</td>
			<td>305</td>
			<td>3660</td>
			<td>0.07</td>
			<td>8.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>600</td>
			<td>44967</td>
			<td>74.95</td>
			<td>134</td>
			<td>1608</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>5dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>51031</td>
			<td>85.05</td>
			<td>163</td>
			<td>1956</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.9</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>1</td>
			<td>600</td>
			<td>60496</td>
			<td>100.83</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.6</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>2</td>
			<td>450</td>
			<td>55517</td>
			<td>123.37</td>
			<td>183</td>
			<td>2196</td>
			<td>0.04</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>3</td>
			<td>600</td>
			<td>88897</td>
			<td>148.16</td>
			<td>465</td>
			<td>5580</td>
			<td>0.06</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>4</td>
			<td>600</td>
			<td>63008</td>
			<td>105.01</td>
			<td>356</td>
			<td>4272</td>
			<td>0.07</td>
			<td>8.4</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>5</td>
			<td>350</td>
			<td>34956</td>
			<td>99.87</td>
			<td>245</td>
			<td>2940</td>
			<td>0.08</td>
			<td>8.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>7dpf</td>
			<td>6</td>
			<td>600</td>
			<td>63887</td>
			<td>106.48</td>
			<td>341</td>
			<td>4092, שעות</td>
			<td>0.06</td>
			<td>7.8</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: סיכום של בידוד מיקרוגלייה ו RNA חילוץ נתונים הזחלים דג זברה dpf 3, 5, 7.
<table fo:font-size="7" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>מזהה דגימה פנימי</td>
			<td>זיהוי הדגימה חיצוני</td>
			<td>קיוביט (ng/ul)</td>
			<td>Qubit(ng/ul)</td>
			<td>ריכוז ממוצע (ng/ul)</td>
			<td>נפח (ul)</td>
			<td>ug התקבל</td>
			<td>עובר או נכשל עבור ריכוז מינימלי</td>
			<td>עובר או נכשל עבור כמות minimim</td>
			<td>עובר או נכשל עבור הכמות המומלצת</td>
		</tr>
<tr>
<td>10907SD0010</td>
			<td>5 dpf (ניסוי 4)</td>
			<td>58.8</td>
			<td>58.4</td>
			<td>58.6</td>
			<td>30</td>
			<td>1.76</td>
			<td>לעבור</td>
			<td>לעבור</td>
			<td>לעבור</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="10">דרישות לדוגמה עבור הספרייה במכינה:</td>
		</tr>
<tr>
<td>הספרייה במכינה</td>
			<td>כמות מינימלית (ng)</td>
			<td>הכמות המומלצת (ng)</td>
			<td>Ng ריכוז מינימלי/uL...</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>ננו TruSeq ג'ל חינם 350 bp הוסף ספריית cDNA</td>
			<td>600</td>
			<td>1100</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 2: כמות בדיקות של cDNA מוגבר מהדגימה RNA של 5 dpf דג זברה מיקרוגלייה.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains at JoVE.com

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

בידוד והפקת RNA של נוירונים, מקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח זחל דג זברה

אנו מציגים פרוטוקול לבודד את הנוירונים, מאקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח דג זברה הזחל בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. על בידוד, RNA מופק מן התאים האלה כדי לנתח את פרופיל ביטוי גנטי. פרוטוקול זה מאפשר האוסף של RNA באיכות גבוהה עבור ביצוע ניתוח במורד הזרם כמו qPCR ו- transcriptomics.

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

isolation-rna-extraction-neurons-macrophages-microglia-from-larval

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K Views.  University of Edinburgh. אנו מציגים פרוטוקול לבודד את הנוירונים, מאקרופאגים מיקרוגלייה מן המוח דג זברה הזחל בתנאים פיזיולוגיים ופתולוגיים. על בידוד, RNA מופק מן התאים האלה כדי לנתח את פרופיל ביטוי גנטי. פרוטוקול זה מאפשר האוסף של RNA באיכות גבוהה עבור ביצוע ניתוח במורד הזרם כמו qPCR ו- transcriptom...

Video: Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

Isolation and Culture of Hippocampal Neurons from Prenatal Mice

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual neurons, researchers are able to analyze properties related to cellular trafficking, cellular structure and individual protein localization using a variety of biochemical techniques. Results from such experiments are critical for testing theories addressing the neural basis of memory and learning. However, unambiguous results from these forms of experiments are predicated on the ability to grow neuronal cultures with minimum contamination by other brain cell types. In this protocol, we use specific media designed for neuron growth and careful dissection of embryonic hippocampal tissue to optimize growth of healthy neurons while minimizing contaminating cell types (i.e. astrocytes). Embryonic mouse hippocampal tissue can be more difficult to isolate than similar rodent tissue due to the size of the sample for dissection. We show detailed dissection techniques of hippocampus from embryonic day 19 (E19) mouse pups. Once hippocampal tissue is isolated, gentle dissociation of neuronal cells is achieved with a dilute concentration of trypsin and mechanical disruption designed to separate cells from connective tissue while providing minimum damage to individual cells. A detailed description of how to prepare pipettes to be used in the disruption is included. Optimal plating densities are provided for immuno-fluorescence protocols to maximize successful cell culture. The protocol provides a fast (approximately 2 hr) and efficient technique for the culture of neuronal cells from mouse hippocampal tissue.

We provide a protocol for the culture of highly purified hippocampal neurons from prenatal mouse brains without the use of a feeder glial cell layer.

בידוד והתרבות של נוירונים בהיפוקמפוס מעכברים טרום לידתי

Primary cultures of rat and murine hippocampal neurons are widely used to reveal cellular mechanisms in neurobiology. By isolating and growing individual ...

Forebrain Electrophysiological Recording in Larval Zebrafish

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked seizures, epilepsy can be acquired as a result of an insult to the brain or a genetic mutation. Efforts to model seizures in animals have primarily utilized acquired insults (convulsant drugs, stimulation or brain injury) and genetic manipulations (antisense knockdown, homologous recombination or transgenesis) in rodents. Zebrafish are a vertebrate model system1-3 that could provide a valuable alternative to rodent-based epilepsy research. Zebrafish are used extensively in the study of vertebrate genetics or development, exhibit a high degree of genetic similarity to mammals and express homologs for ~85% of known human single-gene epilepsy mutations. Because of their small size (4-6 mm in length), zebrafish larvae can be maintained in fluid volumes as low as 100 &mu;l during early development and arrayed in multi-well plates. Reagents can be added directly to the solution in which embryos develop, simplifying drug administration and enabling rapid in vivo screening of test compounds4. Synthetic oligonucleotides (morpholinos), mutagenesis, zinc finger nuclease and transgenic approaches can be used to rapidly generate gene knockdown or mutation in zebrafish5-7. These properties afford zebrafish studies an unprecedented statistical power analysis advantage over rodents in the study of neurological disorders such as epilepsy. Because the "gold standard" for epilepsy research is to monitor and analyze the abnormal electrical discharges that originate in a central brain structure (i.e., seizures), a method to efficiently record brain activity in larval zebrafish is described here. This method is an adaptation of conventional extracellular recording techniques and allows for stable long-term monitoring of brain activity in intact zebrafish larvae. Sample recordings are shown for acute seizures induced by bath application of convulsant drugs and spontaneous seizures recorded in a genetically modified fish.

A simple method to record extracellular field potentials in the larval zebrafish forebrain is described. The method provides a robust in vivo read-out of seizure-like activity. This technique can be used with genetically modified zebrafish larvae carrying epilepsy-related genes or seizures evoked by administration of convulsant drugs.

הקלטת אלקטרו מוח קדמי בזחל דג זברה

Epilepsy affects nearly 3 million people in the United States and up to 50 million people worldwide. Defined as the occurrence of spontaneous unprovoked ...

Isolation and Culture of Dissociated Sensory Neurons From Chick Embryos

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. Studying neurons in vivo can be challenging due to their complexity, their varied and dynamic environments, and technical limitations. For these reasons, studying neurons in vitro can prove beneficial to unravel the complex mysteries of neurons. The well-defined nature of cell culture models provides detailed control over environmental conditions and variables. Here we describe how to isolate, dissociate, and culture primary neurons from chick embryos. This technique is rapid, inexpensive, and generates robustly growing sensory neurons. The procedure consistently produces cultures that are highly enriched for neurons and has very few non-neuronal cells (less than 5%). Primary neurons do not adhere well to untreated glass or tissue culture plastic, therefore detailed procedures to create two distinct, well-defined laminin-containing substrata for neuronal plating are described. Cultured neurons are highly amenable to multiple cellular and molecular techniques, including co-immunoprecipitation, live cell imagining, RNAi, and immunocytochemistry. Procedures for double immunocytochemistry on these cultured neurons have been optimized and described here.

Cell culture models provide detailed control over environmental conditions and thus provide a powerful platform to elucidate numerous aspects of neuronal cell biology. We describe a rapid, inexpensive, and reliable method to isolate, dissociate, and culture sensory neurons from chick embryos. Details of substrata preparation and immunocytochemistry are also provided.

בידוד והתרבות של ניתק עצב סנסורי מאפרוח עוברים

Neurons are multifaceted cells that carry information essential for a variety of functions including sensation, motor movement, learning, and memory. ...

Isolation, Culture and Long-Term Maintenance of Primary Mesencephalic Dopaminergic Neurons From Embryonic Rodent Brains

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes involved in physiological functions and vulnerability and death of these neurons is imparative to understanding the underlying causes and unraveling the cure for this common neurodegenerative disorder. Primary cultures of mesDA neurons provide a tool for investigation of the molecular, biochemical and electrophysiological properties, in order to understand the development, long-term survival and degeneration of these neurons during the course of disease. Here we present a detailed method for the isolation, culturing and maintenance of midbrain dopaminergic neurons from E12.5 mouse (or E14.5 rat) embryos. Optimized cell culture conditions in this protocol result in presence of axonal and dendritic projections, synaptic connections and other neuronal morphological properties, which make the cultures suitable for study of the physiological, cell biological and molecular characteristics of this neuronal population.

The causes of degeneration of midbrain dopaminergic neurons during Parkinson&#8217;s disease are not fully understood. Cellular culture systems provide an essential tool for study of the neurophysiological properties of these neurons. Here we present an optimized protocol, which can be utilized for in vitro modeling of neurodegeneration.

בידוד, תרבות והטווח ארוך תחזוקה של יסודיים mesencephalic דופאמין נוירונים ממוח עוברי מכרסם

Degeneration of mesencephalic dopaminergic (mesDA) neurons is the pathological hallmark of Parkinson&#8217;s diseae. Study of the biological processes ...

Sequential Extraction of Soluble and Insoluble Alpha-Synuclein from Parkinsonian Brains

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, oligomers and fibrils. During disease, &#945;-syn undergoes conformational changes to form oligomers and high molecular weight aggregates that tend to make the protein more insoluble. Abnormally aggregated &#945;-syn is a neuropathological feature of Parkinson&#39;s disease (PD), dementia with Lewy bodies (DLB) and multiple system atrophy (MSA). Biochemical characterization and analysis of insoluble &#945;-syn using buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation provides a powerful tool to determine the development of &#945;-syn pathology associated with disease progression. This protocol describes the isolation of increasingly insoluble/aggregated &#945;-syn from post-mortem human brain tissue. This methodology can be adapted with modifications to studies of normal and abnormal &#945;-syn biology in transgenic animal models harbouring different &#945;-syn mutations as well as in other neurodegenerative diseases that feature aberrant fibrillar deposits of proteins related to their respective pathologies.

Here, we present a protocol for the isolation of increasingly insoluble/aggregated alpha-synuclein (&#945;-syn) from post-mortem human brain tissue. Through the utilization of buffers with increasing detergent strength and high-speed ultracentrifugation techniques, the variable properties of &#945;-syn aggregation in diseased and non-diseased tissue can be examined.

הפקה רציפה של המסיס ובלתי מסיס אלפא-סינוקלאין ממוח פרקינסון

Alpha-synuclein (&#945;-syn) protein is abundantly expressed mainly within neurons, and exists in a number of different forms - monomers, tetramers, ...

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in communication with the epidermal cells they innervate and thus their analysis benefits from in situ visualization of both neuronally and epidermally expressed proteins by immunofluorescence. Traditional methods of preparing larval fillets for immunofluorescence experiments leave intact the muscle tissue that covers most of the body wall, presenting several challenges to imaging neuronal and epidermal proteins. Here we describe a method for removing muscle tissue from Drosophila larval fillets. This protocol enables imaging of proteins that are otherwise obscured by muscle tissue, improves signal to noise ratio, and facilitates the use of super-resolution microscopy to study da neuron development.

Removal of Drosophila Muscle Tissue from Larval Fillets for Immunofluorescence Analysis of Sensory Neurons and Epidermal Cells

Studies of neuronal morphogenesis using Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons benefit from in situ visualization of neuronal and epidermal proteins by immunofluorescence. We describe a procedure that improves immunofluorescence analysis of da neurons and surrounding epidermal cells by removing muscle tissue from the larval body wall.

הסרה של<em&gt; תסיסנית</em&gt; רקמת שריר מן הזחל פילה עבור ניתוח Immunofluorescence של עצב סנסורי ותאי עוריות

Drosophila larval dendritic arborization (da) neurons are a popular model for investigating mechanisms of neuronal morphogenesis. Da neurons develop in ...

Spinal Cord Neurons Isolation and Culture from Neonatal Mice

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on postnatal day 1-3. A mouse litter, usually 4-10 pups born from one breeding pair, is gathered for one experiment, and spinal cords are collected individually from each mouse after euthanasia with isoflurane. The spinal column is dissected out and then the spinal cord is released from the column. The spinal cords are then minced to increase the surface area of delivery for an enzymatic protease that allows for the neurons and other cells to be released from the tissue. Trituration is then used to release the cells into solution. This solution is subsequently fractionated in a density gradient to separate the various cells in solution, allowing for neurons to be isolated. Approximately 1-2.5 x 106 neurons can be isolated from one litter group. The neurons are then seeded onto wells coated with adhesive factors that allow for proper growth and maturation. The neurons take approximately 7 days to reach maturity in the growth and culture medium and can be used thereafter for treatment and analysis.

This study presents a technique for the isolation of neurons from WT neonatal mice. It requires the careful dissection of the spinal cord from the neonatal mouse, followed by the separation of neurons from the spinal cord tissue through mechanical and enzymatic cleavage.

נוירונים חוט השדרה בידוד ותרבות מ עכברים ניאונטליים

We present a protocol for the isolation and culture of spinal cord neurons. The neurons are obtained from neonatal C57BL/6 mice and are isolated on ...

Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has revealed microglia to be dynamic, capable of assuming both pro-inflammatory and anti-inflammatory phenotypes. Both M1 (pro-inflammatory) and M2 (pro-reparative) phenotypes play an important role in neuroinflammatory conditions such as perinatal brain injury, and exhibit differing functions in response to certain environmental stimuli. The modulation of microglial activation has been noted to confer neuroprotection thus suggesting microglia may have therapeutic potential in brain injury. However, more research is required to better understand the role of microglia in disease, and this protocol facilitates that. The protocol described below combines a density gradient centrifugation process to reduce cellular debris, with magnetic separation, producing a highly pure sample of primary microglial cells that can be used for in vitro experimentation, without the need for 2-3 weeks culturing. Additionally, the characterization steps yield robust functional data about microglia, aiding studies to better our understanding of the polarization and priming of these cells, which has strong implications in the field of regenerative medicine.

A protocol for the isolation of primary microglia from murine brains is presented. This technique aids in furthering the current understanding of neurological conditions. Density gradient centrifugation and magnetic separation are combined to produce sufficient yield of a highly pure sample. Furthermore, we outline the steps for characterization of microglia.

אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

ניתוח מטבולית של melanogaster דרוזופילה Larval ושכל למבוגרים

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Rapid Isolation of Dorsal Root Ganglion Macrophages

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after peripheral nerve injury. Peripheral monocytic cells, including macrophages, are known to respond to a tissue injury through phagocytosis, antigen presentation, and cytokine release. Emerging evidence has implicated the contribution of dorsal root ganglia macrophages to neuropathic pain development and axonal repair in the context of nerve injury. Rapidly phenotyping (or &#8220;rapid isolation of&#8221;) the response of dorsal root ganglia macrophages in the context of nerve injury is desired to identify the unknown neuroimmune factors. Here we demonstrate how our lab rapidly and effectively isolates macrophages from the dorsal root ganglia using an enzyme-free mechanical dissociation protocol. The samples are kept on ice throughout to limit cellular stress. This protocol is far less time consuming compared to the standard enzymatic protocol and has been routinely used for our Fluorescence-activated Cell Sorting analysis.

Here we present a mechanical dissociation protocol to rapidly isolate macrophages from the dorsal root ganglion for phenotyping and functional analysis.

הבידוד המהיר של הקרופאגים של השורש

There are growing interests to study the molecular and cellular interactions among immune cells and sensory neurons in the dorsal root ganglia after ...