היתרון העיקרי של פרוטוקול genotyping שלנו הוא שזה ממזער זיהום עם DNA אימהי, שהוא האתגר העיקרי כאשר genotyping פורמלין קבוע, פרפין מוטבע רקמות טוחנות. ציטומטריית זרימה היא שיטה מהירה וזולה המאפשרת מאוד את האבחנה של שומות hydatidiform. עבור כל פרפין קבוע פורמלין מוטבע, או FFPE, תוצר של התעברות, להכין ארבעה מיקרון עבה hematoxylin וכתם אאוסין סעיף כמפורט בסרטון זה להערכה מורפולוגית על ידי מיקרוסקופיה.
מניחים את גושי FFPE על קרח במשך 15 דקות כדי להקל על הסעיף. התאימו את המיקרוטום לחתוך חלקים בעובי ארבעה מיקרון להערכה מורפולוגית מיקרוסקופית. מניחים את הבלוק הקר במיקרוטום וחותכים קטע אחד מכל בלוק עבור כתמי H&E.
באמצעות מדפים, להעביר כל קטע לאמבט מים 45 מעלות צלזיוס. לאסוף את החלק מן אמבט המים עם שקופית טעונה חיובית בעבר שכותרתו עם מספר זיהוי מדגם באמצעות עיפרון. מניחים את השקופיות המכילות את החלקים בתנור בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס כדי לאפשר לחלקים לדבוק בשקופיות.
שמור את השקופיות בתנור במשך 25 דקות. בצע את הכתם של H&E על-ידי טביעת השקופיות בצנצנות הכתמים המתאימות למשך פרק הזמן הנכון כפי שהוא טבלאי בפרוטוקול הטקסט. הר את מקטעי ארבעת המיקרונים לניתוח מורפולוגי עם מדיום הרכבה.
ולכסות עם פתקי כיסוי זכוכית. באמצעות שקופיות H&E ומיקרוסקופ אור, בחר את בלוק FFPE הכולל את הכמות הגדולה ביותר של villi כוריוני. ואם אפשר, הבלוק שיש לו וילי כוריוני נפרד ולא התערבבו עם רקמות אימהיות.
התאימו את המיקרוטום לחתוך חלקים בעובי 10 מיקרון להפקת דנ"א. לחתוך 10 עד 30 חלקים, בהתאם לכמות של villi כוריוני בבלוק. לאחר איסוף המקטעים עם שקופיות כבעבר, מקם את השקופיות המכילות את המקטעים בתנור בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס כדי לאפשר למקטעים לדבוק בשקופיות.
שומרים את השקופיות בתנור למשך 20 דקות. בצע את הכתם של H&E על-ידי טביעת השקופיות בצנצנות הכתמים המתאימות למשך פרק הזמן הנכון כפי שהוא טבלאי בפרוטוקול הטקסט. השאירו את השקופיות מתחת למכסה המנוע של האדים למשך שלוש שעות לפחות על מנת שריחות הקסילן הרעילים יתפוגגו.
בעזרת מדפים, קורעים חתיכת נייר זעירה מנגב נייר לח. תחת מיקרוסקופ סטריאו קל, השתמש במקלפים ובחתיכות קטנות של מגבוני נייר לחים במים כדי לגרד את כל הרקמות האימהיות הלא רצויות מכתמי H&E בעובי 10 מיקרון. המפתח לצעד זה הוא סבלנות, במיוחד עבור בלוקים מאתגרים.
חשוב גם שמישהו אחר יסתכל כדי להבטיח שלא יחסרו רקמות אימהיות. עכשיו, לקרוע פיסת נייר חדשה מתוך מגבוני נייר לחים ולהשתמש בו כדי לאסוף את villi כוריוני. מניחים את חתיכות מגבוני נייר עם villi כוריוני המצורף שלהם לתוך צינור שכותרתו 1.5 מ"ל.
למזער את כמות מגבוני נייר המשמשים בשלב זה כמו יותר מדי עלול לסתום את עמודת החילוץ DNA וכתוצאה מכך להפחית את הכמות הסופית של DNA שנאסף. בצע את פרוטוקול מיצוי ה-DNA מערכת FFPE כדי לבצע מיצוי DNA. באמצעות ספקטרופוטומטר מעבדה, לטעון 1 מיקרוליטר של DNA ולמדוד ספיגה ב 216 ננומטר לכימות.
לטעון 1 microliter של DNA על ג'ל 2%agarose ולהפעיל אלקטרופורזה ג'ל במתח של 80 עד 100 וולט להערכה איכותית. בהתבסס על תוצאות הערכת ה- DNA, בחר את נפח ה- DNA שישמש בהגברת PCR חוזרת דו-מושבית קצרה מולטיפלקס. כוונו להשתמש במינימום של 1000 ננוגרם דנ"א.
המשך להגברת PCR, אלקטרופורזה נימית וניתוח נתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. כדי לבחור את בלוק FFPE האידיאלי, השתמש בשקופיות H&E במיקרוסקופ אור כדי לבחור בלוק FFPE שיש לו בערך 50 עד 70% מהרקמות שלו המורכבות מווילי כוריוני. עבור בלוקים כי אין את הכמות האידיאלית של villi כוריוני, להעשיר עבור villi כוריוני כמו הסעיף מבוצע.
כדי לעשות זאת, לזהות איזה צד של החלקים לחתוך טרי מכיל villi כוריוני יותר על פי שקופית H&E המתאימה שלה. לאחר מכן, השתמש בלהב כדי לחתוך את החצי השני כי צריך להיות מושלך על מנת להעשיר עבור villi כוריוני. כדי לבצע חתך של בלוק FFPE הטוב ביותר האפשרי, לחתוך ארבעה חלקים כי הם 50 מיקרון עבה באמצעות microtome.
במקרה זה בלוק FFPE אידיאלי אינו זמין, שואפים לשמור על היחס של villi כוריוני לרקמה אימהית בכל זאת. לדוגמה, אם רק 30% מהבלוק מורכב מווילי כוריוני, בעוד שלשאר יש רקמות אימהיות, הסר לפחות מחצית מהקטע המכיל את הרקמות האימהיות, ולהשתמש במקטעים נוספים כדי לפצות. מניחים את החלקים בצינורות 15 מ"ל שכותרתו.
עבור deparaffinization ו rehydration, לעבוד במכסה המנוע אדים כדי להוסיף כל reagent ולחכות את פרק הזמן המתאים כפי בטבלה בפרוטוקול הטקסט. לאחר מכן, להסיר את reagent על ידי יניקה ואקום עם פיפטה פסטר. לאחר מכן, להוסיף ארבעה מעלות צלזיוס ציטראט פתרון צינורות 15 מ"ל.
לאחר הנחת 80 מעלות צלזיוס אמבט מים במשך שעתיים, לתת את הפתרון להתקרר לטמפרטורת החדר. הסר את פתרון ציטראט על ידי שאיבת ואקום. מוסיפים שישה מיליליטר של 1x PBS, מערבולת, ולחכות 1-2 דקות כדי לאפשר את הרקמות להתיישב לתחתית.
במידת הצורך, צנטריפוגה הדגימות ב 1000 סל"ד במשך 30 שניות. הסר את PBS 1X על ידי שאיבה ואקום. עכשיו להוסיף מ"ל אחד של פתרון פפסין שחומם מראש ומ מניחים באמבטיה יבשה 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות.
וורטקס כל 10 דקות. הכינו את פרופידיום יודיד ריבונוקלאז פתרון ב -10 הדקות האחרונות של הדגירה הזו. הוסף עוד שישה מ"ל של 1x PBS, מערבולת, ולחכות 1 עד 2 דקות כדי לאפשר את הרקמות להתיישב לתחתית.
שוב, להסיר את PBS 1x על ידי שאיבה ואקום. מוסיפים 550 מיקרוליטרים של הפרופידיום יודיד ריבונוקלאז A פתרון, ומ מניחים את הדגימות באמבטיה יבשה של 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. השתמש מדחפים למקם חתיכה חמישה ס"מ על חמישה ס"מ של רשת סינון 48 מיקרון בחלק העליון של צינורות תחתונים עגולים פוליסטירן לשימוש עם ציטומטר זרימה.
סנן את הפתרון על ידי צינור הנוזל דרך רשת לתוך הצינור. הדגימות מוכנות כעת לפעולה על ציטומטר הזרימה. שמור אותם עטופים בנייר כסף עד שהם מוכנים לרוץ.
לבסוף, בצע ציטומטריית זרימה וניתוח נתונים כמתואר בפרוטוקול הטקסט. מיקרוסטליט genotyping של שומה hydatidiform חלקית, יחד עם ה-DNA של המטופל ובן זוגה, מגלה כי השומה של המטופל הוא דיספרמי triploid. הסמן הראשון מציג שתי פסגות במוצר ההתעברות.
השיא הראשון מקורו באם, שכן רק לאם יש שיא בגודל כזה. בעקבות אותה נימוק, הפסגה השנייה מקורה באב, שכן הוא חולק את אותו אלל. שים לב איך הפסגה השנייה היא הרבה יותר גבוהה מאשר הראשון, המציין כי יש כנראה שתי מנות של אלל אבהי אותו בשיא זה.
זיהום אימהי הוא מינימלי מאוד במוצר זה של התעברות כי זה מציג שיא זעיר מאוד במיקום של אלל אימהי השני. הסמן השני מראה שלוש פסגות במוצר ההתעברות. שתיים מהפסגות הללו מקורן באב, אחת מהאם.
הסמן השלישי והרביעי דומים לסמן הראשון, וגם מראים שני אללים שמגיעים מהאב, ואחד מהאם. מכיוון שכל ארבעת סמנים מראים באופן עקבי שלושה אללים, שניים שמקורם באב ואחד מהאם, ניתן להסיק כי תוצר זה של התעברות הוא דיספרמי טריפלואיד ומאשר את האבחנה של שומה חלקית. לפרשנות של תוצאות genotyping, חשוב להיות מודעים לרמת הזיהום בהתבסס על ההערות שנלקחו במהלך שלבי הניקוי.
במקרים מסוימים, אין באפשרותנו להגיע למסקנה בהתאם לשתי שיטות אלה. במקרים כאלה, אנו משתמשים בשיטות אחרות כגון FISH, כדי לחשוף את הגנוטיפים האמיתיים. Microsatellite genotyping אפשרה אבחון טוחן מדויק וסללה את הדרך להבין טוב יותר את הגנוטיפים הקשורים לתכונות השונות של שומות hydatidiform.
