La principal ventaja de nuestro protocolo de genotipado es que minimiza la contaminación con ADN materno, que es el principal desafío al genotipar tejidos molares fijados en formalina e incrustados en parafina. La citometría de flujo es un método rápido y económico que facilita en gran medida el diagnóstico de lunares hidatidiformes. Para cada producto de concepción de parafina fija fija de formalina, o FFPE, preparar una sección de hematoxilina y tinción de eosina de cuatro micras de espesor, como se detalla en este vídeo para la evaluación morfológica por microscopía.
Coloque los bloques FFPE sobre hielo durante 15 minutos para facilitar el seccionamiento. Ajuste el microtomo para cortar secciones de cuatro micras de espesor para una evaluación morfológica microscópica. Coloque el bloque frío en el microtoma y corte una sección de cada bloque para la tinción de H&E.
Usando fórceps, transfiera cada sección a un baño de agua de 45 grados Celsius. Recoja la sección del baño de agua con un tobogán cargado positivamente previamente etiquetado con el número de identificación de la muestra usando un lápiz. Coloque las diapositivas que contienen las secciones en un horno a 65 grados Celsius para permitir que las secciones se adhieran a las diapositivas.
Mantenga los portaobjetos en el horno durante 25 minutos. Realice la tinción H&E sumergiendo las diapositivas en los frascos de tinción adecuados durante el período de tiempo correcto, tal como se tabula en el protocolo de texto. Monte las secciones de cuatro micras para el análisis morfológico con medio de montaje.
Y cúbrete con los resbalones de la cubierta de vidrio. Usando las diapositivas H&E y un microscopio de luz, seleccione el bloque FFPE que tiene la mayor cantidad de vellosidades coriónicas. Y si es posible, el bloque que tiene vellosidades coriónicas separados y no mezclados con tejidos maternos.
Ajuste el micrototoma para cortar secciones de 10 micras de espesor para la extracción de ADN. Cortar de 10 a 30 secciones, dependiendo de la cantidad de vellosidades coriónicas en el bloque. Después de recoger las secciones con diapositivas como antes, coloque las diapositivas que contienen las secciones en un horno a 65 grados Celsius para permitir que las secciones se adhieran a los portaobjetos.
Mantenga los portaobjetos en el horno durante 20 minutos. Realice la tinción H&E sumergiendo las diapositivas en los frascos de tinción adecuados durante el período de tiempo correcto, tal como se tabula en el protocolo de texto. Deje los portaobjetos debajo de la campana de humo durante un mínimo de tres horas para que los olores tóxicos del xileno se disipenen.
Usando fórceps, saque un pequeño pedazo de papel de una toallita de papel humedecido. Bajo un microscopio estéreo ligero, utilice los fórceps y pequeños trozos de toallitas de papel humedecidas con agua para raspar todos los tejidos maternos no deseados de las manchas de H&E secciones de 10 micras de espesor. La clave para este paso es la paciencia, especialmente para los bloques desafiantes.
También es importante que otra persona eche un vistazo para asegurarse de que no se pierdan tejidos maternos. Ahora, saca un pedazo nuevo de papel de las toallitas de papel humedecidas y úsala para recoger las vellosidades coriónicas. Coloque los trozos de toallitas de papel con sus vellosidades coriónicas adheridas en un tubo etiquetado de 1,5 ml.
Minimice la cantidad de toallitas de papel utilizadas en este paso, ya que demasiado puede obstruir la columna de extracción de ADN y, en consecuencia, reducir la cantidad final de ADN recogido. Siga el protocolo de extracción de ADN de un kit FFPE para realizar la extracción de ADN. Usando un espectrofotómetro de laboratorio, cargue 1 microlitro de ADN y mida la absorbancia a 216 nm para la cuantificación.
Cargue 1 microlitro de ADN en un gel de 2% agarosa y ejecute electroforesis de gel a una tensión de 80 a 100 voltios para una evaluación cualitativa. En función de los resultados de la evaluación de ADN, elija el volumen de ADN que se utilizará en la amplificación de PCR de repetición en tándem corto multiplex. Intenta usar un mínimo de 1000 nanogramos de ADN.
Proceda a la amplificación de PCR, electroforesis capilar y análisis de datos como se describe en el protocolo de texto. Para elegir el bloque FFPE ideal, utilice diapositivas H&E en un microscopio de luz para seleccionar un bloque FFPE que tenga entre el 50 y el 70% de sus tejidos compuestos de vellosidades coriónicas. Para bloques que no tienen la cantidad ideal de vellosidades coriónicas, enriquecer para las vellosidades coriónicas a medida que se realiza la sección.
Para ello, identifique qué lado de las secciones recién cortadas contiene más vellosidades coriónicas de acuerdo con su diapositiva H&E correspondiente. A continuación, utilice una cuchilla para cortar la otra mitad que necesita ser desechada con el fin de enriquecer para las vellosidades coriónicas. Para realizar la sección del mejor bloque FFPE posible, corte cuatro secciones de 50 micras de espesor utilizando un microtoma.
En el caso de que no se disponga de un bloque FFPE ideal, procura mantener la relación entre las vellosidades coriónicas y el tejido materno. Por ejemplo, si sólo el 30% del bloque está compuesto de vellosidades coriónicas, mientras que el resto tiene tejidos maternos, entonces retire al menos la mitad de la sección que contiene los tejidos maternos, y use más secciones para compensar. Coloque las secciones en tubos etiquetados de 15 ml.
Para la desparafinación y la rehidratación, trabaje en una campana de humos para agregar cada reactivo y espere el período de tiempo adecuado según lo tabulado en el protocolo de texto. A continuación, retire el reactivo por aspiración al vacío con una pipeta Pasteur. A continuación, añada cuatro grados de solución de citrato Celsius a los tubos de 15 ml.
Después de colocar en un baño de agua de 80 grados Celsius durante dos horas, deje que la solución se enfríe a temperatura ambiente. Retire la solución de citrato por aspiración al vacío. Agregue seis mililitros de 1x PBS, vórtice, y espere de uno a dos minutos para permitir que los tejidos se asienten en la parte inferior.
Si es necesario, centrifugar las muestras a 1000 RPM durante 30 segundos. Retire el 1X PBS por aspiración al vacío. Ahora agregue un ml de solución de pepsina precalentada y colóquela en un baño seco de 37 grados Celsius durante 30 minutos.
Vórtice cada 10 minutos. Preparar la solución propidium iodide ribonucleasa A en los últimos 10 minutos de esta incubación. Agregue otros seis ml de 1x PBS, vórtice, y espere de uno a dos minutos para permitir que los tejidos se asienten en la parte inferior.
Una vez más, retire el 1x PBS por aspiración al vacío. Añadir 550 microlitros de la solución de ribonucleasa de yoduro de propidium A, y colocar las muestras en un baño seco de 37 grados Celsius durante 30 minutos. Utilice fórceps para colocar una pieza de cinco cm por cinco cm de malla de filtración de 48 micras en la parte superior de los tubos inferiores redondos de poliestireno para su uso con el citómetro de flujo.
Filtrar la solución pipeteando el líquido a través de la malla y en el tubo. Las muestras ya están listas para ejecutarse en el citómetro de flujo. Manténgalos envueltos en papel de aluminio hasta que estén listos para ser ejecutados.
Por último, realice la citometría de flujo y el análisis de datos como se describe en el protocolo de texto. El genotipado de microsatélites de un lunar hidatidiformo parcial, junto con el ADN del paciente y su pareja, revela que el lunar del paciente es dispermático triploides. El primer 1er marcador muestra dos picos en el producto de la concepción.
El primer pico se origina de la madre, ya que sólo la madre tiene un pico de este tamaño. Siguiendo el mismo razonamiento, el segundo pico se origina en el padre ya que comparte el mismo alelo. Observe cómo el segundo pico es mucho más alto que el primero, lo que indica que probablemente hay dos dosis del mismo alelo paterno en ese pico.
La contaminación materna es muy mínima en este producto de la concepción porque muestra un pico muy pequeño en la posición del segundo alelo materno. El segundo marcador muestra tres picos en el producto de la concepción. Dos de estos picos se originan en el padre, y uno de la madre.
El tercer y cuarto marcadores son similares al primer marcador, y también muestran dos alelos provenientes del padre, y uno de la madre. Dado que los cuatro marcadores muestran constantemente tres alelos, dos originarios del padre y uno de la madre, se puede concluir que este producto de la concepción es dispermático triploide y confirma el diagnóstico de lunar parcial. Para la interpretación de los resultados del genotipado, es importante ser consciente del nivel de contaminación basado en las notas tomadas durante los pasos de limpieza.
En algunos casos, no podemos llegar a una conclusión siguiendo estos dos métodos. En tales casos, utilizamos otros métodos como FISH, para descubrir los verdaderos genotipos. El genotipado de microsatélites ha permitido un diagnóstico molar preciso y ha allanado el camino para comprender mejor los genotipos que están asociados con las diversas características de los lunares hidatidiformes.
