מה שאנו מציגים כאן הוא שיטה חזקה ופשוטה לנתח דינמיקה microtubule באמצעות דימות קונפוסל דיסק מסתובב תא חי בתאים מסונכרנים prometaphase, ותמונות מנותחות לאחר מכן על פלטפורמה מבוססת MATLAB. השימוש בחלבון פלואורסצנטי אדום בשילוב עם מיקרוסקופ דיסק מסתובב מפחית פוטוטוקסיות. לכן, מספר גדול יותר של תאים ניתן לדמיין בתוך אותה הכנה.
דינמיקת המיקרוטובול משתנה במספר רב של מצבים פתולוגיים. לכן, הבנת הרגולציה וההתנהגות של דינמיקת המיקרוטובול בתהליכים אלה יכולה לעזור לנו להבין את מנגנון המחלה, ובסופו של דבר לפתח טיפולים כדי לפצות עליהם. השיטה היא גם יוקרתית, כך שזה יכול להיות מיושם במאמץ גילוי סמים.
ניתן לשנות את השיטה על ידי שינוי פרוטוקול desynchronization פלואורסצנטיות וקבלת תאים מהשלבים השונים של מחזור התא. זה יכול להיות שימושי בעת סינון תרופות נגד microtubules וזיהוי פגם על תאים מתחלקים ולא מתחלקים. יש צורך למטב את פרוטוקול ההמרה ואת צפיפות הזריעה עבור כל סוג תא.
רמת הביטוי של EB3 צריכה להיות נמוכה, על מנת לזהות microtubules גדל יחיד. התחל על ידי שטיפה אסינכרונית גדל תאי HeLa ב DPBS, ולאחר מכן דגירה אותם עם טריפסין-EDTA במשך חמש דקות, ב 37 מעלות צלזיוס. הפסק את ההפסקה על-ידי הוספת RPMI-1640 בינוני בתוספת FCS 10%heat מושבת ביחס של שלושה לאחד, טריפסין-EDTA הוסיף.
לחשב את הריכוז של התאים על פי הוראות כתב יד, וזרע 50, 000 תאים לתוך כל באר של מוכן, כריכה קאמרית. מחזירים את הכיסויים לאנקובטור, ומגדלים תאים במשך 24 שעות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני. למחרת, להסיר את התאים מהאינקובטור, ושחרר חכם להוסיף 100 microliters של תערובת transfection לתוך כל באר.
מחזירים את התאים לחממה, ולאחר ארבע שעות של דגירה משלימים את התאים עם מדיום טרי ובנוסף אינקובט במשך 20 שעות. הכן פתרון 2.5 micromolar של dimethylenastron, או DME, ב DMEM חינם אדום פנול, בתוספת 10% FCS ושני מילימולר L-גלוטמין. החלף את מדיום הצמיחה בכיסוי התאי במדיום הצמיחה של DME והחזר את התאים לאנקובטור.
לאחר 3.5 שעות של דגירה, להעביר את התאים למיקרוסקופ על ידי הרכבה כיסוי תא לתוך תא סביבתי להגדיר 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני, עם לוחות כהים להדמיה. לאחר מכן המשיכו את הדגירה במשך ארבע שעות בסך הכל. בצע את הדמיית לשגות הזמן במיקרוסקופ הפוך עם צמצם מספרי 100X, 1.49, מטרת טבילת שמן, מערכת קונפוקל דיסק כפולה, ומערכת מיקוד אוטומטית אמינה.
הגדר את פרמטרי ההדמיה כמתואר בכתב היד של הטקסט. מצא תא בפרופזה, והתמקד במישור Z המתאים למרכז הציר המיטוטי המונופולרי. לאחר מכן לרכוש תמונות כל 5 שניות, על פני סך של דקה אחת, ללא binning וללא תאורה בין חשיפות.
התחל על-ידי טעינת תוכנת הניתוח המספרי והוספת התיקיה V2.2.0 של u-track לנתיב החיפוש של התוכנה, הנקראת GUI של בורר סרטים, מחלון הפקודה. לאחר מכן יבא את הקבצים הגולמיים שנוצרו על-ידי תוכנת רכישת התמונות. הזן באופן ידני את הצמצם המספרי של המטרה ואת מרווח הזמן המשמש להדמיה.
לאחר שכל התמונות נטענות, שמור את סידרת לשגות הזמן שהוזנה כסרט על-ידי בחירה באפשרות שמור כרשימת סרטים ואת אפשרות ה- U-track בצד ימין של חלון הדו-שיח. בחר microtubule plus-ends מהתפריט הנפתח ולחץ על אישור, הפותח חלון דו-שיח חדש כדי לקבוע את הפרמטרים של שלושת שלבי הניתוח. עבור השלב הראשון, לחץ על הגדרות ובחר זיהוי שביט מהתפריט הנפתח.
הגדר את הפרמטרים להבדל של מסנן גאוסיאני ופילוח קו פרשת המים, כמתואר בכתב היד. לאחר מכן בחר החל הגדרות על כל הסרטים ולחץ על החל. עבור השלב השני, בחר את הדינמיקה של microtubule plus-end, ולהשתמש באפשרויות ההגדרה כדי להגדיר את הערכים לקישור, לסגירת רווחים, למיזוג ולפיצול ולפונקציות המסנן של קלמן, בהתאם לכתב היד של הטקסט.
לבעיות בממדיות, בחרו שתיים מהתפריט הנפתח, ולהשתמש בחמש מסגרות לסגירה של רווח מרבי ושלוש מסגרות לאורך מינימלי של מקטעי רצועה מהשדה הראשון. כמו קודם, בחר להחיל הגדרות על כל הסרטים ולחץ על החל. עבור שלב שלישי, בחר סיווג דינמיקת microtubule כשיטה לניתוח מסלול והגדר את הפרמטרים באמצעות לחצן ההגדרה.
בחר את התיבות להסרת רצועות בתחילת הסרט ובסוף הסרט והפוך אותן להיסטוגרמות סטטיסטיקה. מהרשימה הנפתחת, בחר באמצעות שתיים עד שלוש מסגרות לפני רווח קדימה, והאחוזון ה-95 של התפלגות מהירות הפער קדימה, עבור סיווג מחדש קדימה ואחורה, בהתאמה. לאחר הגדרת כל הפרמטרים, בחר החל בדיקה/ביטול סימון על כל הסרטים והפעל את כל תיבות הסרטים מחלון ה- U-track של חלוניות הפקדים ולאחר מכן לחץ על הפעל.
הודעה מוצגת לאחר השלמת עיבוד הסרט. הפלסמיד pEB3-tdTomato בא לידי ביטוי באופן ארעי בתאי הלה. התאים סונכרנו עם טיפול DME.
סרטים לשגות זמן של צמיחת microtubule נותחו, ואת מהירות הצמיחה וכתוצאה מכך ואת הדינמיקה היו התווה. הפרמטרים המתוארים כמשפיעים על הניתוח, כגון אורך רווח מרבי ומגורם הצטמקות מרבי, שונו עבור אותה קבוצה של סרטים לשגות בזמן. הערכים המתאימים של מהירות הצמיחה והדינמיקה חושבו.
בעוד מהירות הצמיחה וכתוצאה מכך לא הושפעה באופן משמעותי, הדינמיקה הייתה שונה כאשר אורך הפער המרבי השתנה. בכל שלושת המקרים, הגילוי של מסלולי משנה microtubule היה דומה, עדיין שחזור של מסלולי MT מלא הושפע בעיקר כאשר אורך הפער המרבי נקבע ל 15. כדי להעריך אם תנאי ההדמיה הפריעו להתנהגות המיקרוטובול, נותחו החצאים הראשון והשני של סדרת הזמן בנפרד, והשוו את מהירות הצמיחה והדינמיקה המתאימות.
כצפוי, לא התגלו הבדלים משמעותיים. חשוב לזכור, כי בגלל התאים מסונכרנים prometaphase, הצפיפות של microtubule הוא גבוה מאוד. לכן, יש להגדיר את הפרמטרים של הניתוח בזהירות רבה, לא כדי מזהה בטעות microtubule שונים.
ניתן להשוות את המדידה של דינמיקת microtubule בשיטה זו עם מחקרים של מטרות ביולוגיות אחרות ישירות, בעקיפין, ויסות microtubules.
