Lo que presentamos aquí es un método robusto y simple para analizar la dinámica de los microtúbulos utilizando imágenes confocales de disco giratorio de células vivas en células sincronizadas en prometafala, y las imágenes se analizan posteriormente en una plataforma basada en MATLAB. El uso de proteína fluorescente de cambio rojo en combinación con la microscopía de disco giratorio reduce la fototoxicidad. Por lo tanto, un mayor número de celdas se puede utilizar una imagen dentro de la misma preparación.
La dinámica de los microtúbulos se altera en un gran número de condiciones patológicas. Por lo tanto, entender la regulación y el comportamiento de la dinámica de los microtúbulos en esos procesos puede ayudarnos a entender el mecanismo de la enfermedad, y eventualmente, desarrollar terapias para compensarlas. Y el método también es upscaleable, por lo que potencialmente podría aplicarse en un esfuerzo de descubrimiento de drogas.
El método se puede modificar cambiando el protocolo de desincronización de fluorescencia y obteniendo células de diferentes fases del ciclo celular. Esto puede ser útil al detectar fármacos contra microtúbulos e identificar defectos en las células divisorias y no divisorias. Es necesario optimizar el protocolo de transfección y la densidad de siembra para cada tipo de célula.
El nivel de expresión de EB3 debe ser bajo, con el fin de detectar microtúbulos de crecimiento único. Comience enjuagando las células de HeLa en crecimiento asincrónico en DPBS, luego incubarlas con trippsina-EDTA durante cinco minutos, a 37 grados centígrados. Detenga la tripsinación añadiendo el medio RPMI-1640 complementado con un FCS 10% inactivado por calor en una proporción de tres a uno, el trypsin-EDTA añadido.
Calcular la concentración de las células de acuerdo con las instrucciones del manuscrito, y sembrar 50.000 células en cada pozo de un cubreobjetos preparado y con cámara. Devuelva el cubreobjetos a la incubadora y las células de cultivo durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, retire las células de la incubadora y agregue 100 microlitros de mezcla de transfección en cada poción.
Devolver las células a la incubadora, y después de cuatro horas de incubación complementar las células con medio fresco y además incubar durante 20 horas. Preparar una solución de 2,5 micromolares de dimetilenastrón, o DME, en DMEM libre de rojo fenol, complementada con 10%FCS y dos milivolares L-glutamina. Sustituya el medio de crecimiento en el cubreobjetos con cámara por el medio de crecimiento DME y devuelva las células a la incubadora.
Después de 3,5 horas de incubación, transfiera las células al microscopio montando el cubreobjetos con cámara en una cámara ambiental de 37 grados centígrados y un 5% de dióxido de carbono, con paneles oscuros para la toma de imágenes. A continuación, continúe la incubación durante un total de cuatro horas. Realice la imagen de lapso de tiempo en un microscopio invertido con una apertura numérica de 100X, 1,49, un objetivo de inmersión de aceite, un sistema confocal de doble disco y un sistema de enfoque automático fiable.
Defina los parámetros de imagen como se describe en el manuscrito de texto. Encontrar una célula en la profasa, y centrarse en el plano Z correspondiente al centro del husillo mitótico monopolar. A continuación, adquiera imágenes cada 5 segundos, durante un total de un minuto, sin binning y sin iluminación entre exposiciones.
Comience cargando el software de análisis numérico y agregando la carpeta u-track V2.2.0 en la ruta de búsqueda de software, llamada GUI selector de película, desde la ventana de comandos. A continuación, importe los archivos sin procesar generados por el software de adquisición de imágenes. Introduzca manualmente la apertura numérica del objetivo y el intervalo de tiempo utilizado para la toma de imágenes.
Una vez cargadas todas las imágenes, guarde la serie de lapso de tiempo introducida como una película seleccionando Guardar como lista de películas y la opción de pista en u en el lado derecho de la ventana de diálogo. Seleccione microtúbulos más extremos en el menú emergente y haga clic en Aceptar, que abre una nueva ventana de diálogo para determinar los parámetros de los tres pasos del análisis. Para el primer paso, haga clic en la configuración y seleccione la detección de cometas en el menú desplegable.
Defina los parámetros para la diferencia del filtro gaussiano y la segmentación de cuencas hidrográficas, como se describe en el manuscrito. A continuación, seleccione Aplicar configuración a todas las películas y haga clic en Aplicar. Para el paso dos, seleccione la dinámica de extremo más del microtúbulo y utilice las opciones de configuración para definir los valores para vincular, cerrar brechas, fusionar y dividir, y las funciones de filtro Kalman, según el manuscrito de texto.
Para problemas con la dimensionalidad, elija dos en el menú desplegable y cinco fotogramas para que el espacio máximo se cierre y tres fotogramas para la longitud mínima de los segmentos de pista desde el primer paso. Como antes, seleccione Aplicar configuración a todas las películas y haga clic en Aplicar. Para el paso tres, elija la clasificación de dinámica de microtúbulos como método de análisis de pista y defina los parámetros a través del botón de configuración.
Seleccione las casillas para eliminar pistas al principio y al final de la película, y haga histogramas de estadísticas. En la lista desplegable, seleccione utilizando dos o tres fotogramas antes del espacio hacia delante y el percentil 95 de la distribución de la velocidad de la brecha hacia delante, para la reclasificación hacia delante y hacia atrás, respectivamente. Una vez definidos todos los parámetros, seleccione Aplicar marcación/desmarcación a todas las películas y ejecute todas las casillas de películas desde la ventana de seguimiento en U de los paneles de control y, a continuación, presione Ejecutar.
Se muestra un mensaje una vez completado el procesamiento de la película. El plásmido pEB3-tdTomato se expresó transitoriamente en las células de HeLa. Las células se sincronizaron con el tratamiento DME.
Se analizaron las películas de lapso de tiempo de crecimiento de los microtúbulos, y se trazaron la velocidad de crecimiento y la dinámica resultantes. Los parámetros descritos para afectar al análisis, como la longitud máxima de separación y el factor de contracción máxima, se modificaron para el mismo conjunto de películas de lapso de tiempo. Se calcularon los valores correspondientes de velocidad de crecimiento y dinámica.
Si bien la velocidad de crecimiento resultante no se vio significativamente afectada, la dinámica era diferente cuando se modificó la longitud máxima de la brecha. En los tres casos, la detección de subpistas de microtúbulos fue similar, sin embargo, la reconstrucción de las trayectorias MT completas se vio afectada principalmente cuando la longitud máxima de la brecha se estableció en 15. Para evaluar si las condiciones de diagnóstico por imágenes interferían con el comportamiento de los microtúbulos, la primera y la segunda mitad de la serie de lapso de tiempo se analizaron por separado, y se compararon la velocidad de crecimiento y la dinámica correspondientes.
Como era de esperar, no se detectaron diferencias significativas. Es importante tener en cuenta, que debido a que las células están sincronizadas en prometaphase, la densidad de microtúbulo es muy alta. Por lo tanto, uno tiene que establecer los parámetros del análisis con mucho cuidado, no para identificar erróneamente diferentes microtúbulos.
La medición de la dinámica de los microtúbulos con este método se puede comparar con estudios de otros objetivos biológicos directamente, indirectamente, regulando los microtúbulos.
