Quello che presentiamo qui è un metodo robusto e semplice per analizzare la dinamica dei microtubuli utilizzando l'imaging confocale del disco rotante a cellule vive nelle cellule sincronizzate in prometafase, e le immagini vengono successivamente analizzate su una piattaforma basata su MATLAB. L'uso di proteine fluorescenti spostate verso il rosso in combinazione con la microscopia a disco rotante riduce la fototossicità. Pertanto, un numero maggiore di celle può essere immaginato all'interno della stessa preparazione.
La dinamicità dei microtubuli è alterata in un gran numero di condizioni patologiche. Pertanto, comprendere la regolazione e il comportamento delle dinamiche dei microtubuli in tali processi può aiutarci a comprendere il meccanismo della malattia e, infine, sviluppare terapie per compensarle. E il metodo è anche di lusso, quindi potrebbe potenzialmente essere applicato in uno sforzo di scoperta di farmaci.
Il metodo può essere modificato modificando il protocollo di desincronizzazione della fluorescenza e ottenendo cellule da diverse fasi del ciclo cellulare. Questo può essere utile quando si vagliano i farmaci contro i microtubuli e si identificano i difetti sulle cellule divisorie e non divisorie. È necessario ottimizzare il protocollo di trasfezione e la densità di semina per ogni tipo di cella.
Il livello di espressione di EB3 dovrebbe essere basso, al fine di rilevare singoli microtubuli in crescita. Iniziare risciacquando le cellule HeLa in crescita asincrona in DPBS, quindi incubarle con tripside-EDTA per cinque minuti, a 37 gradi Celsius. Interrompere la tripsininazione aggiungendo il mezzo RPMI-1640 integrato con FCS inattivato al calore del 10% con un rapporto tre a uno, il trypsin-EDTA aggiunto.
Calcola la concentrazione delle cellule secondo le indicazioni manoscritte e semina 50.000 cellule in ogni pozzo di un coverslip preparato e camerato. Restituire il coverslip all'incubatore e far crescere le cellule per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Il giorno successivo, rimuovere le cellule dall'incubatrice e aggiungere 100 microlitri di miscela di trasfezione in ogni pozzo.
Riportare le cellule nell'incubatrice e dopo quattro ore di incubazione integrare le cellule con mezzo fresco e incubare ulteriormente per 20 ore. Preparare una soluzione micromolare da 2,5 di dimetilnatrone, o DME, in DMEM privo di fenolo rosso, integrata con 10%FCS e due l-glutammina millimolare. Sostituire il mezzo di crescita nel coverslip camerato con il mezzo di crescita DME e riportare le cellule nell'incubatore.
Dopo 3,5 ore di incubazione, trasferire le cellule al microscopio montando il coverslip camerato in una camera ambientale impostata a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica, con pannelli scuri per l'imaging. Quindi continuare l'incubazione per un totale di quattro ore. Eseguire l'imaging time lapse su un microscopio invertito con un'apertura numerica 100X, 1.49, obiettivo di immersione dell'olio, un sistema confocale a doppio disco e un affidabile sistema di messa a fuoco automatica.
Definire i parametri di imaging come descritto nel manoscritto testuale. Trovare una cellula in propase e mettere a fuoco nel piano Z corrispondente al centro del mandrino mitotico monopolare. Quindi acquisire immagini ogni 5 secondi, per un totale di un minuto, senza binning e senza illuminazione tra le esposizioni.
Inizia caricando il software di analisi numerica e aggiungendo la cartella U-track V2.2.0 nel percorso di ricerca software, chiamato GUI del selettore di film, dalla finestra di comando. Quindi importare i file non elaborati generati dal software di acquisizione delle immagini. Immettere manualmente l'apertura numerica dell'obiettivo e l'intervallo di tempo utilizzato per l'imaging.
Una volta caricate tutte le immagini, salvate la serie time lapse immessa come filmato selezionando Salva come elenco di film e l'opzione traccia u sul lato destro della finestra di dialogo. Selezionate i plus-end dei microtubuli dal menu a comparsa, quindi fate clic su ok, che apre una nuova finestra di dialogo per determinare i parametri dei tre passaggi dell'analisi. Per il primo passaggio, fare clic su Impostazioni e selezionare rilevamento comete dal menu a discesa.
Definire i parametri per la differenza tra il filtro gaussiano e la segmentazione dello spartiacque, come descritto nel manoscritto. Quindi selezionare Applica impostazioni a tutti i filmati e fare clic su Applica. Per il secondo passaggio, selezionare la dinamica plus-end del microtubulo e utilizzare le opzioni di impostazione per definire i valori per il collegamento, la chiusura dello spazio, l'unione e la divisione e le funzioni del filtro di Kalman, in base al manoscritto di testo.
Per problemi di dimensionalità, scegliete due dal menu a discesa e usate cinque fotogrammi per la chiusura dello spazio massimo e tre fotogrammi per la lunghezza minima dei segmenti di traccia fin dal primo passo. Come in precedenza, selezionare Applica impostazioni a tutti i filmati e fare clic su Applica. Per il terzo passaggio, scegliete la classificazione delle dinamiche dei microtubuli come metodo di analisi della traccia e definite i parametri tramite il pulsante di impostazione.
Selezionare le caselle per rimuovere le tracce all'inizio e alla fine del filmato ed effettuare istogrammi statistici. Nell'elenco a discesa, selezionate l'utilizzo di due o tre fotogrammi prima dello spazio in avanti e del 95° percentile della distribuzione della velocità dello spazio avanti, rispettivamente per la riclassificazione avanti e indietro. Una volta definiti tutti i parametri, selezionare applica controllo/deseleziona a tutti i filmati ed eseguire tutte le caselle dei filmati dalla finestra u-track dei riquadri di controllo, quindi premere Esegui.
Un messaggio viene visualizzato una volta completata l'elaborazione del filmato. Il pEB3-tdTomato plasmide è stato transiently espresso nelle cellule HeLa. Le cellule sono state sincronizzate con il trattamento DME.
Sono stati analizzati i filmati time lapse della crescita dei microtubuli e sono state tracciate la velocità di crescita e la dinamicità risultanti. I parametri descritti per influenzare l'analisi, ad esempio la lunghezza massima dello spazio e il fattore di restringimento massimo, sono stati modificati per lo stesso set di filmati time lapse. Sono stati calcolati i corrispondenti valori di velocità e dinamicità della crescita.
Sebbene la velocità di crescita risultante non sia stata influenzata in modo significativo, la dinamicità era diversa quando è stata modificata la lunghezza massima dello spazio. In tutti e tre i casi, il rilevamento di sottotracciati di microtubuli era simile, ma la ricostruzione delle traiettorie mt complete è stata influenzata principalmente quando la lunghezza massima dello spazio è stata impostata su 15. Al fine di valutare se le condizioni di imaging interferivano con il comportamento dei microtubuli, la prima e la seconda metà della serie time lapse sono state analizzate separatamente e la corrispondente velocità di crescita e dinamicità sono state confrontate.
Come previsto, non sono state rilevate differenze significative. È importante tenere a mente che poiché le cellule sono sincronizzate in prometafase, la densità del microtubulo è molto alta. Pertanto, è necessario impostare i parametri dell'analisi con molta attenzione, non identificare erroneamente diversi microtubuli.
La misurazione della dinamica dei microtubuli con questo metodo può essere confrontata con studi su altri bersagli biologici direttamente, indirettamente, regolando i microtubuli.
