יחסי הגומלין של חלבונים ופפטידים עם חומר אורגני היא תופעה בסיסית עם השלכות על ננוטכנולוגיה, ביו-חומרים וביוטכנולוגיה. הצעד הראשון בהבנת תופעה כזו הוא חשיפת הקבועים הפיזיקו-כימיים הבסיסיים כגון קבוע סגיפה, אנרגיה חופשית של גיבס, אנתלי, אנטרופיה וספיחה מוגבלת שניתן להעריך באמצעות הקמת איזותרמים של סגיפה. עם זאת, סגנוח מהשלב הנוזלי מוגבל עם קינטיקה, קיבולת פני השטח, pH, ו סחתוע השוואתי אשר כל יש לשקול במודע לפני הגדרת הניסוי.
בסרטון זה, עמיתיי אלנה קורינה וסרגיי ניפרט יציגו את המחקר הפיזיקו-כימי של ספיגת דיפטיד על פתרון לפזר טיטניום דו חמצני מכסה תכונות הכנה שיסייעו למנוע סיכונים נסתרים אשר החוקרים עשויים להתמודד בעת ביצוע ניסויים רלוונטיים. מניחים 183 מיליגרם של דיפפטיד לתוך המבחנה הפולימרית הסטרילית ומדללים עד כ -35 מיליליטר עם מים מזוקקים כפולים ומתמוססים בטמפרטורת החדר תוך ערבוב נמרץ. אם dipeptide לא להתמוסס במים מזוקקים כפולים ומערבבים, מניחים את הפתרון dipeptide לתוך האמבטיה הקולית sonicate במשך כמה דקות.
התאימו את ה-pH של פתרון מומס מראש של פפטיד ל-7.4 על ידי הוספה זהירה של פתרון MES או נתרן הידרוקסידי לתמיסת הדיפטיד בעת ערבוב בטמפרטורת החדר וניטור ה-pH באמצעות מד חומציות. לאחר התאמת ה- pH, יוצקים את הפתרון לתוך גליל מדידה. שוטפים את המבחנה וממלאים את גליל המדידה במים מזוקקים כפולים עד 40 מיליליטר כדי להפוך את הריכוז הסופי של 16 מילימולרים.
הכן דילול דיפטיד עם ריכוזים בין 0.4 ל 12 מילימולאר על ידי דילול 16 מילימולאר דיפפטיד פתרון עם מים מזוקקים כפולים. לדוגמה, על מנת להכין פתרון דיפטיד מילימולארי שמונה מילימולרים, להוסיף שבעה מיליליטר של מים מזוקקים כפולים ל 10 מיליליטר של 16 מילימולר דיפפטיד פתרון. לאחר דילול, להתאים את ה- pH ל 7.4 על ידי הוספת פתרון טיפה חכם של MES או נתרן הידרוקסידי לפתרון דיפטיד.
לאחר התאמת ה- pH, יוצקים את הפתרון לתוך גליל המדידה. שוטפים את המבחנה וממלאים את גליל המדידה עד 20 מיליליטר במים מזוקקים כפולים כדי ליצור ריכוז של שמונה מילימולרים. דילולים אחרים של פתרון מניית dipeptide מוכנים בהתאם.
בסופו של דבר, אנחנו מקבלים שורה של דילולים dipeptide מוכן למחקרי ספיחות. הכן פתרון מאגר MES 10 מילימולר. כוונן את ה- pH ל- 7.4 עם טריסודיום הידרוקסיד בעת ערבוב וניטור ה- pH באמצעות מד pH.
פתרון זה ישמש להכנה הבלעדית. טוחנים כ-200 מיליגרם של תחמוצת טיטניום ננו-קריסטלית במכתש למשך חמש דקות לפחות. לשקול 40 מיליגרם של חלקיקי טיטניום דו חמצני טחינה.
שים את הבקבוק לתוך אמבט sonication באמצעות דוכן המעבדה. מוסיפים את טיטניום דו חמצני לטחון ב 20 מיליליטר של חיץ MES לתוך הבקבוק באמצעות משפך זכוכית sonicate באמבטיה קולית במשך 20 דקות. הגדר את תרמוסטט לטמפרטורה הרצויה.
הוסף מיליליטר אחד של הבלעדית sonicated של טיטניום דו חמצני לבקבוקונים סחוף מסומן. מניחים את בקבוקוני ההסגיפה המסומנים כנגד דילולים תואמים במכשיר צף מאולתר עשוי קלקר ומכניסים אותו לתרמוסטט כדי לצייד את הטמפרטורה במשך חמש דקות לפחות. לאחר מכן, להוסיף מיליליטר אחד של דילול dipeptide לבקבוקון ספיחת המסומן המתאים לוודא כל פתרונות ערבוב יש טמפרטורה זהה.
שמור את הסדרה של דגימות סחוף שהושגו לתרמוסטט במשך 24 שעות כדי להשיג את שיווי המשקל של שפיכה. מדי פעם להתסיס פיזור תחמוצת טיטניום במהלך thermostating. על מנת למנוע שיווי משקל מחדש הנגרמת על ידי טמפרטורה, להוציא מדגם אחד מן תרמוסטט עבור סינון בכל פעם.
קח דגימה של פתרון dipeptide מכל בקבוקון זכוכית עם מזרק. הסר את המחט מהמזרק ולשים על מסנן המזרק כדי לסנן את פתרון dipeptide לתוך בקבוקון זכוכית. חזור על הסינון עם דגימות של ריכוזים אחרים.
עכשיו הדגימות האלה מוכנות לניתוח. הפוך את הפתרון 50 מיליליטר של TFA באצטוניטריל. ספייק 0.34 מיליליטר של TFA בצילינדר המדידה ולהתאים את נפח הפתרון ל 50 מיליליטר עם אצטוניטריל בטמפרטורת החדר.
הכן את פתרון הנגזרת. ספייק 299 microliters של פניליסוטיוצ'יאנט ו 347 microliters של טריאתילאמין בצילינדר מדידה ולמלא את הצילינדר עד 50 מיליליטר עם אצטוניטריל. לפני ניתוח כרומטוגרפיה נוזלית ביצועים גבוהים, לגזור את הדגימות עם reagents של אדמן בבקבוקונים כרומטוגרפיה.
מערבבים את 400 microliters של המדגם עם 400 microliters של reagent נגזרת. שמור את הדגימות ב 60 מעלות במשך 15 דקות. לאחר החימום, לנטרל את הדגימות עם 225 microliters של פתרון TFA ולחכות כמה דקות כדי לקרר את הדגימה לטמפרטורת החדר.
השתמש בניתוח HPLC כדי לקבוע את הריכוז של פתרון dipeptide לפני ואחרי ספיגת. התחל את הניתוח של הדגימות עם התנאים הדרושים אשר מוגדרים על ידי התוכנה. התלות של ספיגת מריכוז דיפטיד שיווי המשקל לאחר ספיגת ספיגת, איזותרמי ספיגת היו מותווים בהתאם לנתונים הניסיוניים שהושגו.
המדידות של ספיגת דיפטיד היו נתונים מעובדים באמצעות מודל הנרי. קבוע קשירה שיווי משקל הושג מן השיפוע של התלות של ספיחה dipeptide על ריכוז שיווי המשקל dipeptide. משוואת ואן-לא-הוף שימשה לקביעת האנרגיה החופשית הסטנדרטית של גיבס לכל טמפרטורה.
עלילה בגרף של אנרגיה חופשית לעומת טמפרטורה, קבענו את האנתלפיה כיירוט של הגרף ליניארי עם ציר אנרגיה חופשית עבור dipeptide. השינוי באנטרופיה לכל טמפרטורה נקבע מהמשוואה הבסיסית. הערכים המחושבים של קבוע מחייב שיווי משקל, אנרגיה חופשית סטנדרטית של גיבס, אנתלפיה ואנטרופיה לדיפטיד מוצגים בטבלה 1.
בניית איזותרם של ספוחה מנתוני דלדול נותרה המתודולוגיה הזמינה ביותר שאינה דורשת הגדרות יקרות, ומספקת נתונים פיזיולוגיים-כימיים ממצים עבור כל סורבט מסיס. בשילוב עם נתונים ספקטרוסקופיים או מבוססי מחשב, הוא עשוי לחשוף תכונות מבניות בסיסיות של התנהגות מורכבת של ביומולקולס בעת יצירת קשר עם חלקיקים אורגניים.
