L'interazione di proteine e peptidi con materiale inorganico è un fenomeno fondamentale con implicazioni per la nanotecnologia, i biomateriali e la biotecnologia. Il primo passo nella comprensione di tale fenomeno è rivelare le costanti fisico-chimiche fondamentali come la costante di adsorbimento, l'energia libera di Gibbs, l'entalpia, l'entropia e l'adsorbimento limitato che possono essere valutate stabilendo isoterme di adsorbimento. Tuttavia, l'adsorbimento dalla fase liquida è limitato con cinetica, capacità superficiale, pH e adsorbimento comparativo che tutti dovrebbero essere consapevolmente considerati prima di impostare l'esperimento.
In questo video, i miei colleghi Elena Korina e Sergei Neifert presenteranno lo studio fisico-chimico dell'adsorbimento del dipeptide sulla soluzione disperde il biossido di titanio coprendo le caratteristiche di preparazione che aiuteranno a evitare rischi nascosti che i ricercatori possono affrontare durante l'esecuzione di esperimenti pertinenti. Posizionare 183 milligrammi di dipeptide nella provetta polimerica sterile e diluire fino a circa 35 millilitri con acqua distillata doppia e sciogliere a temperatura ambiente sotto agitazione vigorosa. Se il dipeptide non si dissolve in acqua distillata doppia e mescolando, posizionare la soluzione dipeptide nel bagno ad ultrasuoni e sonicare per alcuni minuti.
Regolare il pH della soluzione pre-disciolta di un peptide a 7,4 aggiungendo cautamente la soluzione di MES o idrossido di sodio alla soluzione dipeptide mescolando a temperatura ambiente e monitorando il pH con un pHmetro. Dopo aver regolato il pH, versare la soluzione nel cilindro di misura. Risciacquare la provetta e riempire il cilindro di misura con la doppia acqua distillata fino a 40 millilitri per ottenere la concentrazione finale di 16 millimolare.
Preparare diluizioni dipeptide con concentrazioni tra 0,4 e 12 millimolari diluire la soluzione di dipeptide millimolare con acqua distillata doppia. Ad esempio, per preparare otto soluzioni di dipeptide millimolare, aggiungere sette millilitri di acqua distillata doppia a 10 millilitri di soluzione di dipeptide millimolare. Dopo la diluizione, regolare il pH a 7,4 aggiungendo la soluzione per via goccia di MES o idrossido di sodio alla soluzione dipeptide.
Dopo aver regolato il pH, versare la soluzione nel cilindro di misura. Risciacquare la provetta e riempire il cilindro di misura fino a 20 millilitri con acqua distillata doppia per fare una concentrazione di otto millimolare. Di conseguenza vengono preparate altre diluizioni della soluzione di dipeptide stock.
Alla fine, otteniamo una fila di diluizioni dipeptide pronte per gli studi di adsorbimento. Preparare una soluzione tampone MES da 10 millimolare. Regolare il pH a 7,4 con idrossido di trisodio mescolando e monitorando il pH con un misuratore di pH.
Questa soluzione verrà utilizzata per l'unica preparazione. Macinare circa 200 milligrammi di ossido di titanio nanocristallino in una malta per almeno cinque minuti. Pesare 40 milligrammi di nanoparticelle di biossido di titanio.
Mettere il pallone nel bagno di sonicazione utilizzando il supporto di laboratorio. Aggiungere il biossido di titanio macinato in 20 millilitri di buffer MES nel pallone utilizzando l'imbuto di vetro e sonicare in un bagno ad ultrasuoni per 20 minuti. Impostare il termostato alla temperatura desiderata.
Aggiungere un millilitro della suola sonicata di biossido di titanio alle fiale di adsorbimento marcate. Posizionare i flaconcini di adsorbimento marcati contro le corrispondenti diluizioni in un dispositivo galleggiante improvvisato fatto di polistirolo e metterlo nel termostato per equilibrare la temperatura per almeno cinque minuti. Successivamente, aggiungere un millilitro di diluizione del dipeptide al flaconcino di adsorbimento marcato corrispondente assicurandosi che tutte le soluzioni di miscelazione abbiano la stessa temperatura.
Mantenere la serie di campioni di adsorbimento ottenuti sul termostato per 24 ore per raggiungere l'equilibrio di adsorbimento. Occasionalmente agitare le dispersioni di ossido di titanio durante il termostato. Per evitare il nuovo equilibrio indotto dalla temperatura, eserti un campione dal termostato per la filtrazione alla volta.
Preleva un campione della soluzione dipeptide da ogni flaconcino di vetro con una siringa. Rimuovere l'ago dalla siringa e mettere il filtro siringa per filtrare la soluzione dipeptide nel flaconcino di vetro. Ripetere la filtrazione con campioni di altre concentrazioni.
Ora questi campioni sono pronti per l'analisi. Preparare la soluzione da 50 millilitri di TFA in acetonitrile. Punte 0,34 millilitri di TFA nel cilindro di misura e regolare il volume della soluzione a 50 millilitri con acetonitrile a temperatura ambiente.
Preparare la soluzione di derivazione. Punte 299 microlitri di feniletiocianato e 347 microlitrieri di trietilammina nel cilindro di misura e riempire il cilindro fino a 50 millilitri con acetonitrile. Prima dell'analisi della cromatografia liquida ad alte prestazioni, denominare i campioni con i reagenti di Edman nelle fiale cromatografiche.
Mescolare i 400 microlitri del campione con 400 microlitri di reagente di derivazione. Conservare i campioni a 60 gradi per 15 minuti. Dopo il riscaldamento, neutralizzare i campioni con 225 microlitri di soluzione di TFA e attendere alcuni minuti per raffreddare il campione a temperatura ambiente.
Utilizzare l'analisi HPLC per determinare la concentrazione della soluzione dipeptide prima e dopo l'adsorbimento. Avviare l'analisi dei campioni con le condizioni necessarie impostate dal software. Le dipendenze dell'adsorbimento dalla concentrazione del dipeptide di equilibrio dopo l'adsorbimento, gli isotermi di adsorbimento sono state tracciate di conseguenza in base ai dati sperimentali ottenuti.
Le misurazioni dell'adsorbimento del dipeptide sono stati dati elaborati utilizzando il modello Henry. La costante di legame di equilibrio è stata ottenuta dalla pendenza della dipendenza dell'adsorbimento del dipeptide dalla concentrazione di equilibrio del dipeptide. L'equazione di van't Hoff è stata usata per determinare l'energia libera standard di Gibbs per ogni temperatura.
Tracciati in un grafico dell'energia libera rispetto alla temperatura, abbiamo determinato l'entalpia come intercettazione del grafo lineare con un asse di energia libera per il dipeptide. Il cambiamento di entropia per ogni temperatura è stato determinato dall'equazione fondamentale. I valori calcolati della costante di legame di equilibrio, dell'energia libera standard di Gibbs, dell'entalpia e dell'entropia per il dipeptide sono presentati nella tabella uno.
La costruzione dell'isoterma di adsorbimento dai dati di esaurimento rimane quella più disponibile che non richiede configurazioni costose, fornendo dati fisico-chimici esaustivi per letteralmente ogni sorbato solubile. Combinato con dati spettroscopici o computerizzati, può rivelare caratteristiche strutturali fondamentali del comportamento complesso delle biomolecole al contatto con le nanoparticelle inorganiche.
