A interação de proteínas e peptídeos com material inorgânico é um fenômeno fundamental com implicações para nanotecnologia, biomateriais e biotecnologia. O primeiro passo para compreender tal fenômeno é revelar as constantes físico-químicas fundamentais, como a constante de adsorção, a energia livre de Gibbs, a entalpia, a entropia e a adsorção limitada que podem ser avaliadas através do estabelecimento de isotherms de adsorção. No entanto, a adsorção da fase líquida é restrita com cinética, capacidade de superfície, pH e adsorção comparativa que todos devem ser conscientemente considerados antes de definir o experimento.
Neste vídeo, meus colegas Elena Korina e Sergei Neifert apresentarão o estudo físico-químico da adsorção de dipeptídeos na solução dispersar recursos de preparação de dióxido de titânio que ajudarão a evitar riscos ocultos que os pesquisadores podem enfrentar durante a realização de experimentos relevantes. Coloque 183 miligramas de dipeptídeo no tubo de ensaio polimérico estéril e dilua até aproximadamente 35 mililitros com água dupla destilada e dissolva à temperatura ambiente sob agitação vigorosa. Se o dipeptídio não se dissolver em água dupla destilada e mexer, coloque a solução de dipeptídeo no banho ultrassônico e sonicato por alguns minutos.
Ajuste o pH da solução pré-dissolvida de um peptídeo para 7,4 adicionando cautelosamente a solução de MES ou hidróxido de sódio à solução de dipeptídeo ao mexer à temperatura ambiente e monitorar o pH com um medidor de pH. Depois de ajustar o pH, despeje a solução em cilindro de medição. Enxágüe o tubo de ensaio e encha o cilindro de medição com a água dupla destilada até 40 mililitros para fazer a concentração final de 16 mililitros.
Prepare diluições de dipeptídeos com concentrações entre 0,4 e 12 milimonas diluindo a solução de dipeptida de 16 milimonas com água dupla destilada. Por exemplo, para preparar oito soluçãos de dipeptídeo milimona, adicione sete mililitros de água dupla destilada a 10 mililitros de solução de dipeptida de 16 milimilhas. Após a diluição, ajuste o pH para 7,4 adicionando solução em termos de gota de MES ou hidróxido de sódio à solução dipeptide.
Depois de ajustar o pH, despeje a solução no cilindro de medição. Enxágüe o tubo de ensaio e encha o cilindro de medição até 20 mililitros com água dupla destilada para fazer uma concentração de oito milimiliar. Outras diluições da solução de estoque de dipeptídeos são preparadas em conformidade.
No final, temos uma linha de diluições de dipeptídeos prontas para estudos de adsorção. Prepare a solução de buffer MES de 10 milimôlares. Ajuste o pH para 7,4 com hidróxido de trissódio ao mexer e monitorar o pH com um medidor de pH.
Esta solução será usada para a preparação exclusiva. Triture aproximadamente 200 miligramas de óxido de titânio nanocristalino em uma argamassa por pelo menos cinco minutos. Pesar 40 miligramas de nanopartículas de dióxido de titânio.
Coloque o frasco no banho de sônica usando o suporte de laboratório. Adicione o dióxido de titânio de moagem em 20 mililitros de tampão MES no frasco usando o funil de vidro e sonicato em um banho ultrassônico por 20 minutos. Coloque o termostato na temperatura desejada.
Adicione um mililitro da sola sonicada de dióxido de titânio aos frascos de adsorção marcados. Coloque os frascos de adsorção marcados contra diluições correspondentes em um dispositivo flutuante improvisado feito de isopor e coloque-o no termostato para equilibrar a temperatura por pelo menos cinco minutos. Depois disso, adicione um mililitro de diluição de dipeptídeo ao frasco de adsorção marcado correspondente certificando-se de que todas as soluções de mistura tenham a mesma temperatura.
Mantenha a série de amostras de adsorção obtidas no termostato por 24 horas para alcançar o equilíbrio de adsorção. Ocasionalmente agita dispersões de óxido de titânio durante a termoestração. Para evitar o re-equilíbrio induzido pela temperatura, retire uma amostra do termostato para filtração de cada vez.
Pegue uma amostra da solução dipeptida de cada frasco de vidro com uma seringa. Retire a agulha da seringa e coloque o filtro de seringa para filtrar a solução de dipeptídeo no frasco de vidro. Repita a filtragem com amostras de outras concentrações.
Agora essas amostras estão prontas para análise. Faça a solução de 50 mililitros de TFA em acetonitrila. Espete 0,34 mililitros de TFA no cilindro de medição e ajuste o volume da solução para 50 mililitros com acetonitrilo à temperatura ambiente.
Prepare a solução de derivatização. Espetar 299 microliters de fenilismo e 347 microlitadores de trietilamina no cilindro de medição e encher o cilindro até 50 mililitros com acetonitrilo. Antes da análise de cromatografia líquida de alto desempenho, derivatize as amostras com os reagentes de Edman nos frascos de cromatografia.
Misture os 400 microliters da amostra com 400 microliters de reagente de derivatização. Mantenha as amostras a 60 graus por 15 minutos. Após o aquecimento, neutralize as amostras com 225 microliters de solução TFA e espere alguns minutos para esfriar a amostra à temperatura ambiente.
Use a análise HPLC para determinar a concentração da solução dipeptide antes e depois da adsorção. Inicie a análise das amostras com as condições necessárias definidas pelo software. As dependências da adsorção da concentração de dipeptídeo de equilíbrio após a adsorção, os isotherms de adsorção foram plotados de acordo com os dados experimentais obtidos.
As medidas de adsorção de dipeptide foram dados processados usando o modelo Henry. A constante de ligação de equilíbrio foi obtida a partir da inclinação da dependência da adsorção de dipeptídeo na concentração de equilíbrio de dipeptídeos. A equação van't Hoff foi usada para determinar a energia padrão de Gibbs livre para cada temperatura.
Traçar em um gráfico de energia livre versus temperatura, determinamos a entalpia como interceptação do gráfico linear com um eixo de energia livre para dipeptídio. A mudança na entropia para cada temperatura foi determinada a partir da equação fundamental. Os valores calculados de equilíbrio de ligação constante, energia livre padrão gibbs, entalpia e entropia para dipeptídio são apresentados na tabela um.
A construção de isotherm adsorpor dados de esgotamento continua sendo a metodologia mais disponível que não requer configurações caras, fornecendo dados físico-químicos exaustivos para literalmente todos os sorbatos solúveis. Combinado com dados espectroscópicos ou baseados em computador, pode revelar características estruturais fundamentais do comportamento complexo das biomoléculas ao entrar em contato com as nanopartículas inorgânicas.
