La interacción de proteínas y péptidos con material inorgánico es un fenómeno fundamental con implicaciones para la nanotecnología, los biomateriales y la biotecnología. El primer paso para comprender este fenómeno es revelar las constantes fisicoquímicas fundamentales como la constante de adsorción, la energía libre de Gibbs, la entalpía, la entropía y la adsorción limitada que pueden evaluarse mediante el establecimiento de isotérmicas de adsorción. Sin embargo, la adsorción de la fase líquida está restringida con cinética, capacidad superficial, pH y adsorción comparativa que todos deben ser considerados conscientemente antes de establecer el experimento.
En este video, mis colegas Elena Korina y Sergei Neifert presentarán el estudio fisicoquímico de la adsorción dipéptido sobre la solución dispersar dióxido de titanio que cubre características de preparación que ayudarán a evitar riesgos ocultos que los investigadores pueden enfrentar mientras realizan experimentos relevantes. Coloque 183 miligramos de dipéptido en el tubo de ensayo polimérico estéril y diluya hasta aproximadamente 35 mililitros con agua doble destilada y disuelva a temperatura ambiente bajo agitación vigorosa. Si el dipéptido no se disuelve en agua destilada doble y agitación, coloque la solución de dipéptido en el baño ultrasónico y sonicar durante unos minutos.
Ajustar el pH de la solución pre-disuelta de un péptido a 7.4 añadiendo con cautela la solución de MES o hidróxido de sodio a la solución de dipéptido al agitar a temperatura ambiente y controlar el pH con un medidor de pH. Después de ajustar el pH, vierta la solución en el cilindro de medición. Enjuague el tubo de ensayo y llene el cilindro de medición con el agua destilada doble de hasta 40 mililitros para hacer la concentración final de 16 milimolares.
Preparar diluciones dipéptidos con concentraciones entre 0,4 y 12 milimolar diluyendo 16 solución de dipéptido mililolar con agua destilada doble. Por ejemplo, para preparar una solución de dipéptido milimotora de ocho milivolares, añada siete mililitros de agua destilada doble a 10 mililitros de solución de dipéptido mililolar de 16 mililitros. Después de la dilución, ajuste el pH a 7.4 añadiendo una solución gota a gota de MES o hidróxido de sodio a la solución de dipéptido.
Después de ajustar el pH, vierta la solución en el cilindro de medición. Enjuague el tubo de ensayo y llene el cilindro de medición hasta 20 mililitros con agua doble destilada para hacer una concentración de ocho mililitros. Otras diluciones de la solución de dipéptido se preparan en consecuencia.
Al final, tenemos una fila de diluciones de dipéptido listo para estudios de adsorción. Prepare una solución tampón MES de 10 mililitros. Ajuste el pH a 7.4 con hidróxido de trisódico al agitar y monitorear el pH con un medidor de pH.
Esta solución se utilizará para la preparación única. Moler aproximadamente 200 miligramos de óxido de titanio nanocristalino en un mortero durante al menos cinco minutos. Pesar 40 miligramos de muelas de dióxido de titanio nanopartículas.
Coloque el matraz en el baño de sonicación utilizando el soporte de laboratorio. Añadir el dióxido de titanio de molienda en 20 mililitros de tampón MES en el matraz utilizando el embudo de vidrio y sonicar en un baño ultrasónico durante 20 minutos. Ajuste el termostato a la temperatura deseada.
Añadir un mililitro de la suela sonicada de dióxido de titanio a los viales de adsorción marcados. Coloque los viales de adsorción marcados contra las diluciones correspondientes en un dispositivo flotante improvisado hecho de espuma de poliestireno y colóquelo en el termostato para equilibrar la temperatura durante al menos cinco minutos. Después de eso, añadir un mililitro de dilución de dipéptido al vial de adsorción marcado correspondiente asegurándose de que todas las soluciones de mezcla tienen la misma temperatura.
Mantenga la serie de muestras de adsorción obtenidas en el termostato durante 24 horas para lograr el equilibrio de adsorción. Ocasionalmente agitar las dispersiones de óxido de titanio durante el termostatizado. Para evitar el recesoje inducido por la temperatura, saque una muestra del termostato para su filtración a la vez.
Tome una muestra de la solución de dipéptido de cada vial de vidrio con una jeringa. Retire la aguja de la jeringa y colóquela en el filtro de la jeringa para filtrar la solución de dipéptido en el vial de vidrio. Repita la filtración con muestras de otras concentraciones.
Ahora estas muestras están listas para el análisis. Haga la solución de 50 mililitros de TFA en acetonitrilo. Spike 0,34 mililitros de TFA en el cilindro de medición y ajustar el volumen de la solución a 50 mililitros con acetonitrilo a temperatura ambiente.
Prepare la solución de derivación. Spike 299 microlitros de feniisotiocianato y 347 microlitros de trietilamina en el cilindro de medición y llenar el cilindro hasta 50 mililitros con acetonitrilo. Antes del análisis de cromatografía líquida de alto rendimiento, deriva las muestras con los reactivos de Edman en los viales de cromatografía.
Mezclar los 400 microlitros de la muestra con 400 microlitros de reactivo de derivación. Mantenga las muestras a 60 grados durante 15 minutos. Después del calentamiento, neutralice las muestras con 225 microlitros de solución TFA y espere unos minutos para enfriar la muestra a temperatura ambiente.
Utilice el análisis de HPLC para determinar la concentración de la solución de dipéptido antes y después de la adsorción. Iniciar el análisis de las muestras con las condiciones necesarias que se establecen por el software. Las dependencias de adsorción de la concentración de dipéptido de equilibrio después de la adsorción, isotermas de adsorción se trazaron en consecuencia a los datos experimentales obtenidos.
Las mediciones de la adsorción dipéptido fueron datos procesados utilizando el modelo Henry. La constante de unión de equilibrio se obtuvo de la pendiente de la dependencia de la adsorción de dipéptidos en la concentración de equilibrio del dipéptido. La ecuación van't Hoff se utilizó para determinar la energía libre estándar de Gibbs para cada temperatura.
Trazado en un gráfico de energía libre versus temperatura, determinamos la entalpía como intercepción del gráfico lineal con un eje de energía libre para dipéptido. El cambio en la entropía para cada temperatura se determinó a partir de la ecuación fundamental. Los valores calculados de la constante de unión de equilibrio, la energía libre estándar de Gibbs, la entalpía y la entropía para el dipéptido se presentan en la tabla uno.
La construcción de isoterma de adsorción a partir de datos de agotamiento sigue siendo la metodología más disponible que no requiere configuraciones costosas, proporcionando datos fisicoquímicos exhaustivos para literalmente cada sorbato soluble. Combinado con datos espectroscópicos o basados en computadora, puede revelar características estructurales fundamentales del comportamiento complejo de las biomoléculas al entrar en contacto con las nanopartículas inorgánicas.
