פרוטוקול זה שימושי לקביעת שינויים בהפעלת NF-kappa-B בתאים המבטאים כתב NF-קאפה-B לוציפראז. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת מסך תפוקה גבוהה של גורמים או תנאים שמובילים לשינויים בהפעלת NF-kappa-B. NF-kappa-B הוא גורם שעתוק עבור מגוון רחב של תהליכים סלולריים.
פונקציה ידועה של NF-kappa-B היא אינדוקציה של תגובות דלקתיות על ידי גרימת הביטוי של ציטוקינים שונים כימוקין. המעבדה שלנו מתעניינת במיוחד בגיוס של NF-kappa-B המושרה על ידי טיפימוריום סלמונלה פתוגן. כאן, אנו משתמשים בקו התא HeLa כי הוא שונה באופן הדוק עם NF-קאפה-B לוציפראז כתב פלסמיד.
חיידקים אחרים, או אפילו וירוסים או תרכובות כימיות, ניתן להשתמש בקו תא זה כדי ללמוד את ההפעלה של NF-kappa-B. קווי תא אחרים יכולים לשמש גם אם אתה יכול להציג כזה NF-kappa-B לוציפראז כתב פלסמיד באותו קו התא. מישהו עושה את זה בפעם הראשונה אולי יש בעיות כראוי ניצול טכניקה סטרילית הנדרשת עבור תרבות התא עבודה חיידקית.
יום אחד לפני גירוי התא, להסיר את המדיה הצמיחה של תאי HeLa 57A שגדלו על 75% confluency. לשטוף תאים עם מיליליטר אחד של 0.05% טריפסין EDTA. החלף עם מיליליטר נוסף של טריפסין EDTA ולהעביר את הבקבוק ל 37 מעלות צלזיוס אינקובטור במשך חמש דקות.
לאחר התאים נותקו מן הבקבוק, להשעות אותם 10 מיליליטר של מדיה צמיחה. שלבו 10 מיקרוליטרים של מתלי תאים עם 10 מיקרוליטרים של כחול טריפאן, פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב, והעבר 10 מיקרוליטרים לשקופית מונה תאים. לספור תאים בהשעיה באמצעות מונה תאים, ולהשתמש במדיה צמיחה כדי לדלל את התאים לריכוז סופי של 2.5 פעמים 10 לחמשת התאים למיליליטר בצינור חרוט 50 מיליליטר.
להעביר 250 microliters של ההשעיה התא לכל באר של צלחת 48 באר. מעת לעת כובע ולהפוך את הצינור חרוט כדי להבטיח השעיית תא הומוגני. הקישו על הצלחת בעדינות בצד כדי לוודא שהתאים מתפזרים באופן אחיד בארות.
מעבירים את הצלחת ל-37 מעלות בממפה של 5% פחמן דו חמצני ומאפשרים לתאים להתחבר ולגדול בן לילה. פסים מלאי קפוא של סלמונלה על צלחות אגר LB לייצר מושבות בודדות. מעבירים את הצלחות לאנקובטור ב-37 מעלות ומאפשרים צמיחה של לילה.
למחרת, להוסיף שלושה מיליליטר של LB לצינורות תרבות חיידקי סטרילי, ולהוסיף אנטיביוטיקה מתאימה לתקשורת. באמצעות לולאת חיסון סטרילית, בחר מושבה אחת מתרבות החיידקים המפוספסות וגע בלולאה למדיית LB. מכסים את הצינורות לאחר חינוך ומשליכים את הלולאה.
מניחים את הצינורות באינקובטור רועד שנקבע על 37 מעלות צלזיוס ו 180 סל"ד, ולאחר מכן לאפשר את החיידקים לגדול בן לילה. בבוקר, לאחזר תרבות חיידקיות לילה מהאספה. הכן צינורות עבור תת תרבות על ידי הוספת שלושה מיליליטר של LB טרי ואנטיביוטיקה.
העבר 30 מיקרוליטרים של תרבות החיידקים בן הלילה למדיה הטרייה. מניחים את הצינורות באינקובטור רועד שנקבע על 37 מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות. לאחר הדגירה של שלוש שעות, להעביר מיליליטר אחד של מרק LB סטרילי לתוך cuvette פלסטיק לשמש ריק.
העבר 900 microliters של LB לתוך cuvettes אחרים כדי לשמש לניתוח מדגם. מעבירים 100 מיקרוליטרים של תת-תרבות חיידקית לקובט המכילה 900 מיקרוליטרים של LB, ופיגט למעלה ולמטה מספר פעמים כדי לערבב. חזור על זה עבור כל השעיה חיידקית.
הפעל את הספקטרופוטומטר כדי למדוד את הצפיפות האופטית של תרבות החיידקים באורך גל של 600 ננומטר. מניחים את הריק בספקטרופוטומטר. שים לב לכיוון.
סגור את המכסה ולחץ על הכפתור הריק בספקטרופוטומטר כדי לקבל את ספיגת הרקע. החלף את ה- cuvette הריק ב cuvette לדוגמה באותו כיוון ולחץ על קרא. רשום את ערכי OD600 של דוגמאות אלה.
הכפל את הערך ב- 10 כדי להסביר את גורם הדילול. לדלל את ההשעיה אחד עד 10 ב cuvette ולמדוד ספיגה, אשר צריך לתת ערך של כ 0.1 אשר בערך מתאים פעם אחת 10 לתשעה CFU למיליליטר. בצינור חדש, להוסיף נפח מתאים של תת תרבות מדולל LB טרי כדי להשיג השעיה של פעם אחת 10 לשמונה CFU למיליליטר לשמש inoculum.
הכן דילול סדרתי של inoculum על ידי העברת 50 microliters של השעיה חיידקית לצינור המכיל 450 microliters של PBS סטרילי עד דילול סופי של כ 100 CFU למיליליטר נעשה. להעביר 100 microliters של שני הדילולים הנמוכים ביותר, 100 ו 1000 CFU למיליליטר, לשתי צלחות אגר LB, ולהפיץ את ההשעיה עם מפזר תאים כדי להשיג מושבות בודדות. מעבירים את הצלחות האלה לאנקובטור של 37 מעלות וחממה למשך הלילה.
למחרת, לספור את המושבות ולחשב את הריכוז החיידקי של inoculum הראשונית כדי לקבוע את ריכוז inoculum בפועל. באותו יום, תווית המכסה של הצלחת על פי תנאי הזיהום שישמש עבור כל באר, עם כל מצב נעשה triplicate. הוסף 10 microliters של inoculum ל בארות המתאימות, ולהוסיף 10 microliters של LB סטרילי ל בארות שליטה לא מושפעות.
כדי לסנכרן את זמן ההדבקה, מניחים את הצלחת בצנטריפוגה שולחן ולסובב ב 500 פעמים G במשך חמש דקות, להבטיח כי הצלחת מאוזנת. לאחר מכן, להעביר את התאים הנגועים אינקובטור 5%פחמן דו חמצני ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. מניחים צינור חרוט 15 מיליליטר המכיל aliquot של מדיה תרבות התא באמבט מים 37 מעלות צלזיוס לשימוש בשלב הבא.
שעה לאחר זמן ההדבקה, להסיר את הצינור חרוט 15 מיליליטר המכיל מדיה תרבות התא מן אמבט המים ולנגב את החלק החיצוני עם 70% אתנול. מעבירים את צלחות תרבות הרקמות מהחממה לארון ביו-בטיחותי. השתמשו בטיפים סטריליים כדי לשוטוף מדיה מה בארות ולהחליף ב-250 מיקרוליטרים של מדיית תרבות תאים רעננה וחמה.
החזירו את הלוחות לאנקובטור של 5% פחמן דו-חמצני ב-37 מעלות צלזיוס למשך ארבע שעות נוספות. לאחר מכן, הסר את הצלחות מאינקובטור הפחמן הדו חמצני ושואב את התקשורת מה בארות. לניתוח לוציפראז, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של מאגר תות תאים 1X ל הבארות.
מעבירים את הצלחת למקפיא שלילי של 80 מעלות ודגירה למשך 30 דקות לפחות כדי להבטיח תות תא יעיל. לאחר מכן, מניחים את הצלחת המכילה lysate תא קפוא על ספסל להפשיר, ולהכין reagents מצע לוציפראז על פי המלצות היצרן. אפשרו לריג'נטים של מצע לוציפראז לצייד לטמפרטורת החדר.
לאחר מכן, הפעל את קורא הלוחות ופתח את תוכנית הקורא המתאימה. הגדר את המכונה כדי למדוד זוהר. מעבירים 10 מיקרוליטרים של כל תא lysate ל הבאר של צלחת אטומה 96 באר.
בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הוסיפו 50 מיקרוליטרים של ה-luciferase assay reagent לכל באר של הצלחת הא אטומה. הקישו בעדינות על הצלחת בצד כדי לערבב בארות, ווודאו שהמשטח התחתון מכוסה בנוזל. מניחים את הלוחית על קורא לוחות ויוזם קריאה.
העתק את ערכי האלוהות לתוכנית גיליון אלקטרוני והתוות את התוצאות. פרוטוקול זה מתמקד בהפעלת גורם התמלול NF-kappa-B באמצעות כתב לוציפראז תלוי NF-kappa-B כי הוא שונה באופן הדוק לתוך שורה של תאי HeLa. נתון זה מציג ניסוי מייצג של הפעלת לוציפראז תלוי NF-kappa-B וביטוי גנים IL6 בתאי HeLA 57A נגועים בזני טיפימוריום סלמונלה.
זיהום עם סוג הבר SL1344 זן גרם אות luciferase חזק הן בביטוי RLU ו IL6, אשר ירד בתאים נגועים מוטציה משולשת sopB sopE2 sipA והצטמצם כדי לשלוט ברמות עם מוטציית sopE2 sopE sopE מרובע sipA. שים לב כשאתה עושה את הדילולים הסדרתיים שלך וציפוי. זה יבטיח כי יש לך inoculum עקבי על פני הזנים שלך.
לאחר זיהוי גורמים התורמים להפעלת NF-kappa-B ושינויים במורד הזרם בביטוי mRNA, ניתן להשתמש בטכניקת הכתם המערבית כדי לזהות שינויים בביטוי החלבון. פרוטוקול זה אפשר למעבדה שלנו לא רק להעריך את הפעלת NF-kappa-B הנגרמת על ידי סלמונלה, אלא תרכובות וחלבונים אחרים המעורבים בהפעלת NF-kappa-B. טיפימוריום סלמונלה הוא פתוגן אנושי.
להעסיק PPE הנכון בעת עבודה עם חיידקים אלה.
