שיטה זו יכולה לשמש כדי התחת איך סוכנים טיפוליים חדשניים או אסטרטגיות, להשפיע או להגדיל את התגובה תא T cytotoxic במהלך סרטן הלבלב. טכניקה זו מאפשרת גידולים להיות מתעכל במהירות מגורה במבחנה, המאפשר ניתוח של פרמטרים מרובים של תגובת תא T בו זמנית, אשר ניתן להתאים בקלות עבור יישומים אחרים. כדי להתחיל, להשתמש במדפים, להעביר את הגידול על צלחת פטרי.
לאחסן חמישה מיליליטר של מדיום עיכול בצינור 50 מיליליטר על קרח כדי למנוע פעילות אנזימים להתחיל. קח aliquot קטן של פתרון זה, כדי לכסות את הגידול על צלחת פטרי. השתמש אזמל סטרילי ממטרים לחתוך את הגידול לחתיכות קטנות, בערך פחות משלושה מילימטרים אורך.
לגרד את חתיכות הגידול לתוך הצינור, בעדינות להפוך את הצינור עד כל החלקים שקועים בתקשורת העיכול. מעבירים את הצינור למכשיר רועד למשך 20 דקות ב-37 מעלות לעיכול. ודא שכל חתיכות הגידול שקועות, ולא דבוקות לקצה הצינור.
מיד לאחר שלב העיכול, מניחים את הצינור על הקרח כדי להאט את פעילות האנזים. הוסף EDTA כדי להשיג ריכוז סופי של 20 מילימולר, בקצרה מערבולת המדגם לערבב על מנת להאט עוד יותר את פעילות האנזים. פתח את הצינור ולשטוף כל עיכול הגידול את המכסה של הצינור עם מדיום RPMI טרי.
ואז להכין מסננת 70 מיקרון, למקם אותו על צינור פתוח 50 מיליליטר על קרח. הרטב מראש את המסנן עם בינוני. השתמשו מחדש בתאים המתעכלים ושטפו את דפנות הצינור באמצעות רצועה גדולה יותר באורך 25 מיליליטר.
הפתיח הרחב יותר של הרצועה מאפשר לתקציר העבה לעבור בקלות. להעביר את כל העיכול על מסננת, באמצעות Stripette 25 מיליליטר. מועכים מעלה ומטה את הגידול על גבי המסנן באמצעות בוכנה מזרק מיליליטר אחד.
לשטוף תאים ברציפות דרך מסננת עם RPMI. הקפד לשטוף עם מספיק כוח כדי לדחוף את התאים דרך. ממשיכים לשטוף עד שכל התאים עוברים דרך מסננת.
צנטריפוגה הצינור במשך חמש דקות ב 300 פעמים G, וארבע מעלות צלזיוס. בזהירות resuspend את גלולת התא, ולהשלים RPMI, ולהעביר ישירות דרך מסנן אחר כדי להסיר כל מטריצה חוץ תאית, או גושים תא גדולים שלא ניתן לעכל כראוי. אם אין צורך בגירוי, יש להכתים מיד את התאים המבודדים לניתוח ציטומטריית זרימה, או למצות אותם מחדש במדיום הקפאה של 10%DMSO ו-FBS, ולאחסן במינוס 80 מעלות צלזיוס.
כדי לבצע גירוי, לספור תחילה את התאים. לדלל את התאים במדיום מלא כדי להשיג ריכוז של פעמיים עשר עד שש לכל 100 microliters. צלחת 100 microliters של תאים בכל באר של U-bottomed 96 צלחת היטב.
הוסף 100 מיקרוליטרים של מדיום מלא, המכיל הכנה 2X של PMA, ו Ionomycin. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס, אבל 5% פחמן דו חמצני במשך שעה אחת. לאחר מכן, ב 20 microliters של הכנה 10X של ברפלדין A, ו Monensin, ומדיה מלאה כדי להשיג ריכוז סופי של 1.06 micromolar, ו 2.0 micromolar, בהתאמה.
תחזיר את הצלחת לאנקובטור לעוד ארבע שעות. לאחר הזרקת 1000 תאים TB32048 לתוך הלבלב, גידולים אורתוטופיים לקחת בערך 30 ימים לפתח. לאחר עיכול וגירוי של גידולים אורתוטופיים שנקטפו, התבצעה פלואורסצנטיות מינוס אחת כדי לקבוע פלואורסצנטיות ברקע עבור gating.
וברפלדין א מונסין רק שליטה בוצעה כדי לקבוע ייצור בסיס של ציטוקיני. עבור דגירה אינטרפרון-גמא עם ברפלדין A ומונסין, הביא שום עלייה גמא אינטרפרון על בקרת FMO, הן טחול ודגימות גידול. עם זאת, התוספת של PMA ו ionomycin, גדל אחוז גמא אינטרפרון תאית לזיהוי הן טחול וגידול נגזר CD4 חיובי CD8 חיובי T תאים.
לתאי T חיוביים ו-CD8 חיוביים של CD8, המשמשים כבקרה חיובית, יש ייצור גמא אינטרפרון גבוה יחסית, מאשר תת-קבוצות תאי T שחודרות לגידולים. ציון דיכוי חיסוני מתרחש בתוך הגידול. באמצעות אותה אסטרטגיה עבור אלפא TNF, אחוז גבוה של תאי T חיוביים CD4 הטחול היו חיוביים עבור אלפא TNF תאית.
בהשוואה לתאי CD4 חיוביים שחודרים לגידולים. תאים T חיוביים CD8 חדירת ט, הפיק רמות דומות של אלפא TNF. ודא הגידול הוא קצוץ מספיק, כי כל החלקים שקועים בתקשורת העיכול.
בעת ריסוך הגידול, הקפד להיות עדין, ולשטוף תאים דרך ביסודיות. ניתן לשלב את פרוטוקול עיכול הגידול עם מיון תאים בסיוע זרימה, כדי לטהר תת-קבוצות בודדות של תאי מערכת החיסון לניתוח נוסף, פונקציונלי או ביטוי גנים. השתמשנו בשיטה זו כדי לאפיין כיצד תאי B מעצבים את התגובה החיסונית במהלך סרטן הלבלב, ויוצרים גידולים אורתוטופיים הן בנוקאאוט של תאי B והן בעכברים מרוקנים מתאי B.
