يمكن استخدام هذه الطريقة في إجراء الأساليب الجديدة للعوامل العلاجية أو الاستراتيجيات، والتأثير على استجابة الخلايا التائية السامة للخلايا أثناء سرطان البنكرياس أو زيادة هذه الاستجابة. تسمح هذه التقنية بالأورام أن تكون سريعة الهضم وحفزها في المختبر ، مما يسمح بتحليل معلمات متعددة لاستجابة الخلية T في وقت واحد ، والتي يمكن تكييفها بسهولة لتطبيقات أخرى. للبدء، استخدم ملقط، ونقل الورم على طبق بتري.
تخزين خمسة ملليلتر من هضم المتوسطة في أنبوب 50 ملليلتر على الجليد لمنع نشاط انزيم بدء. تأخذ aliquot صغيرة من هذا الحل، لتغطية الورم على طبق بيتري. استخدام مشرط معقمة والملقط لقطع الورم إلى قطع صغيرة، ما يقرب من ثلاثة ملليمترات في الطول.
كشط قطع الورم في الأنبوب ، وعكس الأنبوب بلطف حتى تغمر جميع القطع في وسائل الإعلام الهضم. نقل أنبوب على جهاز اهتزاز لمدة 20 دقيقة في 37 درجة مئوية لهضم. تأكد من أن جميع قطع الورم مغمورة بالمياه، وغير ملتصقة بحافة الأنبوب.
مباشرة بعد خطوة الهضم، وضع أنبوب على الجليد لإبطاء نشاط الانزيم. إضافة EDTA لتحقيق تركيز نهائي من 20 ملليمولار، ودوامة لفترة وجيزة العينة لخلط من أجل مزيد من النشاط الإنزيمات بطيئة. فتح أنبوب وشطف أي ورم هضم قبالة غطاء الأنبوب مع متوسطة RPMI الطازجة.
ثم إعداد مصفاة 70 ميكرون، وضعه على أنبوب مفتوح 50 ملليلتر على الجليد. قبل الرطب مرشح مع المتوسطة. resuspend الخلايا المهضومة وغسل جانبي الأنبوب باستخدام Stripette 25 ملليلتر أو أكبر.
يسمح الافتتاح الأوسع لممر Stripette بتمرير هضمة سميكة بسهولة. نقل كل من خلاصة على مصفاة، وذلك باستخدام Stripette 25 ملليلتر. الهريس صعودا وهبوطا الورم على رأس المرشح باستخدام مغمس حقنة ملليلتر واحد.
غسل الخلايا باستمرار من خلال مصفاة مع RPMI. تأكد من أن يغسل مع ما يكفي من القوة لدفع الخلايا من خلال. استمر في الغسل حتى تمر جميع الخلايا عبر المصفاة.
جهاز طرد مركزي الأنبوب لمدة خمس دقائق في 300 مرة G، وأربع درجات مئوية. إعادة تعليق الخلية بعناية، واستكمال RPMI، وتمرير مباشرة من خلال مرشح آخر لإزالة أي مصفوفة خارج الخلية، أو كتل الخلايا الكبيرة التي لا يمكن إعادة تعليقها بشكل كاف. إذا لم يكن هناك حاجة إلى التحفيز ، على الفور وصمة عار الخلايا المعزولة لتحليل تدفق قياس الخلايا ، أو resuspend لهم في وسط تجميد 10 ٪ DMSO و FBS ، وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية.
لإجراء التحفيز، عد أولاً الخلايا. تمييع الخلايا في المتوسط الكامل لتحقيق تركيز من 2x0 إلى 6 لكل 100 ميكرولترات. لوحة 100 ميكرولترات من الخلايا في كل بئر من يو القاع 96 لوحة جيدا.
إضافة 100 ميكرولترات من المتوسط الكامل، التي تحتوي على إعداد 2X من PMA، والأيونوميسين. ضع الصفيحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية، ولكن 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. ثم، في 20 ميكرولتررس من إعداد 10X من Brefeldin A، وMoensin، ووسائل الإعلام كاملة لتحقيق تركيز نهائي من 1.06 ميكرومولار، و 2.0 ميكرومولار، على التوالي.
ضع اللوحة مرة أخرى في الحاضنة لمدة أربع ساعات أخرى. بعد حقن 1000 TB32048 الخلايا في البنكرياس، الأورام التقويمية يستغرق حوالي 30 يوما لتطوير. بعد الهضم وتحفيز أورام تقويم العظام المحصودة ، تم إجراء مضل ناقص واحد لتحديد الفلورس الخلفية للبوابات.
وBrefeldin A Monensin فقط تم تنفيذ السيطرة لتحديد الإنتاج القاعدي من السيتوكينات. لاحتضان إنترفيرون غاما مع Brefeldin A و Monensin، أدى إلى أي زيادة في غاما إنترفيرون على السيطرة FMO، في كل من الطحال وعينات الورم. ومع ذلك، إضافة PMA والأيونوميسين، وزيادة النسبة المئوية من انترفيرون غاما داخل الخلايا يمكن الكشف عنها في كل من splenic والورم المشتقة CD4 إيجابية وCD8 الخلايا T إيجابية.
Splenic CD4 إيجابية وCD8 الخلايا التائية الإيجابية, تستخدم كتحكم إيجابي, لديها أعلى نسبيا إنتاج غاما إنترفيرون, من الخلايا الفرعية التي تتسرب الورم. يشير إلى كبت المناعة يحدث داخل الورم. باستخدام نفس الاستراتيجية لـ TNF ألفا، كانت نسبة عالية من الخلايا T CD4 إيجابية splenic إيجابية لـ TNF ألفا داخل الخلايا.
مقارنة مع الورم تسلل CD4 الخلايا التائية الإيجابية. Splenic والورم تسلل CD8 الخلايا التائية الإيجابية، أنتجت مستويات مماثلة من ألفا TNF. تأكد من أن الورم مفروم بما فيه الكفاية، وأن جميع القطع مغمورة في وسائل الهضم.
عند تهرس الورم، تأكد من أن تكون لطيفة، وغسل الخلايا من خلال دقيق. يمكن دمج بروتوكول هضم الورم مع فرز الخلايا بمساعدة التدفق ، لتنقية المجموعات الفرعية الفردية من الخلايا المناعية لتحليل التعبيرات الإضافية أو الوظيفية أو الجينية. لقد استخدمنا هذه الطريقة لوصف كيفية تشكيل الخلايا B الاستجابة المناعية أثناء سرطان البنكرياس، وتوليد أورام العظام في كل من خروج المغلوب الخلية B والفئران ب الخلية المنضب.
