Este método pode ser usado para entender como novos agentes terapêuticos ou estratégias, influenciam ou aumentam a resposta celular citotóxica T durante o câncer de pâncreas. Esta técnica permite que os tumores sejam rapidamente digeridos e estimulados in vitro, permitindo a análise de múltiplos parâmetros da resposta da célula T simultaneamente, que podem ser facilmente adaptados para outras aplicações. Para começar, use fórceps, transfira o tumor para uma placa de petri.
Armazene cinco mililitros de meio de digestão em um tubo de 50 mililitros no gelo para evitar o início da atividade enzimácica. Tome uma pequena alíquota desta solução, para cobrir o tumor na placa de Petri. Use um bisturi estéril e fórceps para cortar o tumor em pequenos pedaços, aproximadamente menos de três milímetros de comprimento.
Raspe os pedaços do tumor no tubo e inverta suavemente o tubo até que todos os pedaços estejam submersos na mídia de digestão. Transfira o tubo para um dispositivo de agitação por 20 minutos a 37 graus celsius para digerir. Certifique-se de que todos os pedaços do tumor estão submersos, e não grudados na borda do tubo.
Imediatamente após a etapa de digestão, coloque o tubo no gelo para retardar a atividade enzimácica. Adicione EDTA para alcançar uma concentração final de 20 milimililar, e brevemente vórtice a amostra para misturar a fim de aumentar ainda mais a atividade enzimática. Abra o tubo e enxágue qualquer tumor digerir a tampa do tubo com meio RPMI fresco.
Em seguida, prepare um coador de 70 mícrons, coloque-o em um tubo aberto de 50 mililitros no gelo. Pré-molhar o filtro com meio. Resuspenque as células digeridas e lave as laterais do tubo usando uma Stripette de 25 mililitros ou maiores.
A abertura mais ampla do Stripette permite que a digestão grossa passe facilmente. Transfira todo o digestor para o coador, usando a Stripette de 25 mililitros. Amasse o tumor em cima do filtro usando um êmbolo de seringa de um mililitro.
Lave continuamente as células através do coador com RPMI. Certifique-se de lavar com força suficiente para empurrar as células através. Continue lavando até que todas as células passem pelo coador.
Centrifugar o tubo por cinco minutos a 300 vezes G, e quatro graus Celsius. Ressuspense cuidadosamente a pelota da célula e complete o RPMI, e passe diretamente por outro filtro para remover qualquer matriz extracelular, ou grandes aglomerados de células que não possam ser adequadamente ressuspended. Se não for necessária estimulação, manche imediatamente as células isoladas para análise de citometria de fluxo, ou resuspensá-las em meio de congelamento de 10% DMSO e FBS, e armazenar a menos 80 graus Celsius.
Para realizar a estimulação, primeiro conte as células. Diluir as células em meio completo para alcançar uma concentração de duas vezes dez a seis por 100 microliters. Placa 100 microliters de células em cada poço de uma placa de 96 poços com fundo U.
Adicione 100 microliters de meio completo, contendo uma preparação 2X de PMA, e Ionomicina. Coloque a placa em uma incubadora a 37 graus celsius, mas 5% dióxido de carbono por uma hora. Em seguida, a 20 microlitres de uma preparação de 10X de Brefeldin A, e Monensin, e mídia completa para alcançar uma concentração final de 1,06 micromolar, e 2.0 micromolar, respectivamente.
Coloque o prato de volta na incubadora por mais quatro horas. Depois de injetar 1000 células tb32048 no pâncreas, tumores ortotópicos levam aproximadamente 30 dias para se desenvolver. Após a digestão e estimulação dos tumores ortotópicos colhidos, foi realizada uma fluorescência menos uma para determinar a fluorescência de fundo para gating.
E Brefeldin A Monensin só foi realizado para determinar a produção basal de citocinas. Para a incubação interferon-gama com Brefeldin A e Monensin, resultou em nenhum aumento na gama de interferon sobre o controle de FMO, tanto no baço quanto nas amostras de tumores. No entanto, a adição de PMA e ionomicina, aumentou o percentual de gamma de interferon intracelular detectável tanto em células T espínicas quanto derivadas do tumor e CD8 positivas.
As células T positivas do CD4 e CD8, usadas como controle positivo, têm uma produção gama de interferon relativamente maior do que subconjuntos de células T infiltrados em tumores. A indicação da imunossupressão ocorre dentro do tumor. Usando a mesma estratégia para TNF alfa, uma alta porcentagem de células T positivas CD4 esplênicas foram positivas para o TNF alfa intracelular.
Comparado com células T cd4 positivas infiltradas em tumores. Células T cd8 positivas e esplênicas e infiltradas em tumores, produziram níveis semelhantes de TNF alfa. Certifique-se de que o tumor está suficientemente picado, e que todas as peças estão submersas em mídia de digestão.
Ao amassar o tumor, certifique-se de ser gentil, e lavar as células completamente. O protocolo de digestão do tumor pode ser combinado com a classificação celular assistida por fluxo, para purificar subconjuntos individuais de células imunes para análises adicionais, funcionais ou de expressão genética. Usamos este método para caracterizar como as células B moldam a resposta imune durante o câncer de pâncreas, gerando tumores ortotópicos tanto em células B quanto em camundongos com células B.
