פיתחנו מודל חדשני של כדוריות תלת מימדיות המציע פלטפורמה לחקר אינטראקציות סרטן-סטרומה ולבדוק טיפולים בסרטן. לדעתי, מערכת תלת מימד זו משלבת תאים סרטניים בסטרומה פיברובלסט כדי לחקות טוב יותר תנאי גידול אמיתיים ולכן יכולה להיות כלי רב עוצמה לגילוי תרופות. בנוסף, מודל זה אינו מוגבל ללמוד מלנומה.
זה יכול לשמש כדי לחקור סוגים אחרים של סרטן. הדגמת ההליך תהיה ד"ר Hongwei שאו, מדען בכיר מהמעבדה שלי. עבור תרבות תאי מלנומה אנושית, לזרוק את התאים תחת תנאי תרבות תאים חסידים קונבנציונליים להשלים W489 בינוני ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני.
כאשר התאים מגיעים ל- 90%confluency, פצל את התאים ביחס של 1 עד 5. עבור תרבות פיברובלסט עור העכבר, לשטוף את כדורי רקמה שנקטפו PBS לפני culturing הדגימות ו DMEM בתוספת 10 אחוז סרום שור עוברי, ואחוז אחד פניצילין-סטרפטומיצין באינקובטור תרבות התא. לפצל את התאים ביחס של אחד לשניים כאשר הם מגיעים לקונפליה של 90 אחוז.
לפני הגדרת cocultures, fibroblasts זרע על צלחת 100 מילימטר בריכוז, כך הקונפדרציה התא יגיע כ 60 אחוז למחרת. למחרת בבוקר, להחליף את supernatant עם ריכוז של אחד עד שלושה עד חמישה של GFP כדי lentivirus מדולל מהמלאי בתרבות הרגילה בינוני בתוספת ארבעה מיקרוגרם למיליליטר של פוליברן. מניחים את התאים לתוך אינקובטור תרבות התא במשך שש שעות לפני החלפת supernatant עם מדיום תרבות טרי.
לאחר יומיים, יש להתבונן באות GFP מהתאים במיקרוסקופ פלואורסצנטי. כאשר שתי תרבות התאים נותפו באופן הדוק, נתק את שתי תרבות התאים מ- 0.25 טריפסין-EDTA כדי לאסוף את המתלים של תא יחיד על ידי קנטוביגציה. להשעות מחדש את התאים פעמיים 10 עד 4 תאים למיליליטר של ריכוז בינוני coculture ולערבב את תאי מלנומה fibroblasts ביחס של אחד לאחד.
לאחר מכן לראות שני מיליליטר של תאים לכל באר של צלחת 24 היטב ו triplicate עבור כל תנאי ולה מניחים את הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך ארבע שעות כדי לאפשר לתאים לצרף לתחתית הצלחת. עבור תרבות סולו תא מלנומה להעריך היווצרות אשכול תאים 2D, לראות פעמיים 10 לתאי מלנומה הרביעי לתוך כל באר של 24 גם צלחת ותרבות התאים במשך שבעה עד 10 ימים באינקובטור תרבות התא. ואז לצלם את התאים על מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך על פי פרוטוקולים מיקרוסקופיים פלואורסצנטיים סטנדרטיים.
אם מערכת ההדמיה של זמן ההדמיה כבויה, הפעל אותה לפחות שעה אחת לפני ההדמיה. כאשר המערכת מוכנה, בזהירות להעביר את צלחת התרבות לשלב של מיקרוסקופ להחליק את החממה ולנעול את הדלת בבטחה. פתח את התוכנה של מערכת הדמיה לשגות זמן ולחץ להוסיף כלי כדי לבחור את סוג הלוח ואת היצרן כך מיקרוסקופ יכול לאתר את אזור הסריקה במדויק.
בחר עדשה אובייקטיבית 10 פעמים ואת הבארות של עניין ולהגדיר את הפרמטרים עבור אזור הסריקה, את זמן המרווח בין הסריקות ואת זמן ההתחלה והסיום. ואז להקליט את הדמיה לשגות זמן מארבע עד 52 שעות. בסוף הקלטת התמונה, השתמש בתוכנת מערכת ההדמיה של זמן לשגות כדי לאחזר את הנתונים ולייצא את קטעי הווידאו שנאספו או ערכות תמונה.
להדמיה מיקרוסקופית קונפוקאלית של cocultures, מניחים את הצלחת על הבמה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך ולבחור את קרני לייזר אדום וירוק. שימו לב לתאים תחת מטרה של פי 5 או 10 ובחרו את הכדור כדי להתחיל בסריקה. באמצעות מיקרון z-צעד אחד, לסרוק מלמטה לראש הכדור.
לאחר מכן עבד את הנתונים באמצעות תוכנת עיבוד התמונה המתאימה כדי לבנות מחדש תמונה תלת-מימדית שניתן לסובב ולשמר עוד יותר כסרט תלת-מימדי. כאן מוצגות תמונות של כדוריות תלת-מימדיות רב-תאיות שנוצרו על ידי תאי מלנומה ותאי פיברובלסטים. תאי מלנומה מתורבתים בהעדר פיברובלסטים אינם יוצרים כדוריות תלת-מימדיות טיפוסיות, אם כי חלק מתאים מלנומה יוצרים אשכולות דו-מימדיים עם תרבות מורחבת.
באמצעות הדמיה לשגות זמן, fibroblasts ותאי הגידול ניתן לראות אינטראקציה coculture, החל ספרואידים בערך 36 שעות. בסרט זה, ניתן לראות את התהליך הדינמי של היווצרות צבירה של תאי מלנומה מתורבתים בודדים מארבע עד 52 שעות של תרבות. כאן, מבנה ספרואיד 3D ניתן לראות על ידי מיקרוסקופיה confocal לאחר שבעה ימים של תרבות, בעוד בסרט זה, אשכול תאים 2D ניתן לדמיין.
כדוריות תלת מימדיות נשארות תלויות בתרבות בינונית וניידות, בעוד אשכולות תאים סרטניים 2D נוטים לצרף את צלחת התרבות והם חסרי תנועה. מודל תלת מימד זה משמש כפלטפורמה ייחודית לחקר אינטראקציות גידול-סטרומה. לדוגמה, להבהרת האופן שבו Notch1 בין תאי איתות פעילות מסלול וסרטן הקשורים fibroblasts לווסת את גזע הסרטן וייזום היווצרות תאים וספורואידים.
בנוסף, מודל זה יכול לשמש כדי לבדוק את התגובות התרופה של גזע סרטן וייזום תאים. למרות ששיטה זו היא פשוטה וישר קדימה, יש לדאוג להשתמש בצפיפות התאים ויחס התאים הנכונים, ולהשתמש בצלחות התרבות המתאימות כפי שהוכח. מודל 3D זה יכול להיות מיושם גם עבור או sedating חיוני פעילות מסלול איתות תאית לקביעת פנוטיפים של תאי גזע סרטניים, כמו גם הקרנת תרכובות מולקולה קטנה אשר תאי גזע סרטניים רגישים מאוד.
