Hemos desarrollado un nuevo modelo de esferoides 3D que ofrece una plataforma para estudiar las interacciones cáncer-estroma y probar las terapias contra el cáncer. Desde mi punto de vista, este sistema 3D combina células cancerosas en un fibroblasto estroma para imitar mejor las condiciones tumorales genuinas y, por lo tanto, puede ser una herramienta muy poderosa para el descubrimiento de fármacos. Además, este modelo no se limita al estudio del melanoma.
Se puede utilizar para investigar otros tipos de cánceres. Hongwei Shao, un científico senior de mi laboratorio. Para el cultivo celular del melanoma humano, arroje las células bajo condiciones convencionales de cultivo celular adherente y complete el medio W489 a 37 grados centígrados en 5% dióxido de carbono.
Cuando las células alcancen el 90% de confluencia, divida las celdas en una proporción de uno a cinco. Para el cultivo de fibroblastos de la piel de ratón, lave los gránulos de tejido cosechado en PBS antes de cultivar los especímenes y DMEM complementado con un 10 por ciento de suero bovino fetal, y un uno por ciento de penicilina-estreptomicina en la incubadora de cultivo celular. Divida las celdas en una proporción de uno a dos cuando alcancen una confluencia del 90 por ciento.
Antes de establecer las coculturas, los fibroblastos de semillas en un plato de 100 milímetros a una concentración tal que la confluencia celular alcance aproximadamente el 60 por ciento al día siguiente. A la mañana siguiente, sustituya el sobrenadante por una concentración de uno a tres a uno a cinco de GFP a lentivirus diluido de las existencias en un medio de cultivo regular complementado con cuatro microgramos por mililitro de polibreno. Coloque las células en la incubadora de cultivo celular durante seis horas antes de reemplazar el sobrenadante por un medio de cultivo fresco.
Después de dos días, observe la señal GFP de las células en un microscopio de fluorescencia. Cuando ambos cultivos celulares han sido trans infectados de forma estable, separe ambos cultivos celulares de 0.25 trypsin-EDTA para recoger las suspensiones de una sola célula por centuvigación. Re suspenda las células en una proporción de dos veces 10 a cuartas células por mililitro de la concentración media de cocultivo y mezcle las células del melanoma y los fibroblastos en una proporción de uno a uno.
Luego vea dos mililitros de células a cada pozo de una placa de 24 pozos y triplicar para cada condición y coloque la placa en la incubadora de cultivo celular durante cuatro horas para permitir que las células se adhieran a la parte inferior de la placa. Para que el cultivo en solitario de células de melanoma evalúe la formación de grupos celulares 2D, vea dos veces 10 a las cuartas células de melanoma en cada pozo de una placa de 24 pozos y esctice las células durante siete a 10 días en la incubadora de cultivo celular. A continuación, fotografíe las células en un microscopio de fluorescencia invertido de acuerdo con los protocolos de microscopía fluorescente estándar.
Si el sistema de imágenes de lapso de tiempo está apagado, enciéndalo al menos una hora antes de la toma de imágenes. Cuando el sistema esté listo, transfiera cuidadosamente la placa de cultivo a la etapa del microscopio y deslice la incubadora y cierre la puerta de forma segura. Abra el software del sistema de imágenes de lapso de tiempo y haga clic en añadir recipiente para seleccionar el tipo de placa y el fabricante para que el microscopio pueda localizar el área de escaneo con precisión.
Seleccione una lente objetivo 10 veces y los pozos de interés y establezca los parámetros para el área de escaneo, el tiempo de intervalo entre los escaneos y una hora de inicio y finalización. A continuación, registre la imagen de lapso de tiempo de cuatro a 52 horas. Al final de la grabación de imágenes, utilice el software del sistema de imágenes de lapso de tiempo para recuperar los datos y exportar los vídeos o conjuntos de imágenes recopilados.
Para la microscopía confocal de las coculturas, coloque la placa en el escenario de un microscopio de fluorescencia invertido y seleccione los rayos láser rojo y verde. Observe las celdas bajo un objetivo de cinco o 10 veces y seleccione el esferoide para comenzar a escanear. Usando un paso z de un micrón, escanee desde la parte inferior hasta la parte superior del esferoide.
A continuación, procese los datos utilizando el software de procesamiento de imágenes adecuado para reconstruir una imagen 3D que se puede rotar y guardar como una película 3D. Aquí, se muestran imágenes de esferoides 3D multicelulares formados por células de melanoma cocultivo y fibroblastos. Las células del melanoma cultivadas en ausencia de fibroblastos no forman esferoides 3D típicos, aunque algunas células del melanoma forman grupos 2D con cultivo prolongado.
Usando imágenes de lapso de tiempo, se pueden observar fibroblastos y células tumorales interactuando en la cocultura, comenzando desde esferoides a unas 36 horas. En esta película, se puede observar el proceso dinámico de formación de agregados celulares de melanoma cultivado único de cuatro a 52 horas de cultivo. Aquí, una estructura esferoidosa 3D se puede observar por microscopía confocal después de siete días de cultivo, mientras que en esta película, se puede visualizar un cúmulo de células 2D.
Los esferoides 3D permanecen suspendidos en el medio de cultivo y son móviles, mientras que los racimos de células tumorales 2D tienden a adherirse a la placa de cultivo y son inmóviles. Este modelo 3D sirve como una plataforma única para estudiar las interacciones tumoral-estroma. Por ejemplo, para esclarecer cómo la actividad intercelular de la vía de señalización de la vía y los fibroblastos asociados al cáncer regulan el tallo del cáncer e inician la formación de células y esferoides.
Además, este modelo se puede utilizar para probar las respuestas de los medicamentos del tallo del cáncer y las células que inician. Aunque este método es simple y directo, tenga cuidado de utilizar la densidad celular correcta y la relación de celda, y utilizar las placas de cultivo adecuadas como se ha demostrado. Este modelo 3D también se puede aplicar para sedar la actividad crucial de la vía de señalización intracelular para determinar los fenotipos de las células madre cancerosas, así como para la detección de compuestos de moléculas pequeñas a los que las células madre cancerosas son altamente sensibles.
