המחברים מודים חנה Voersmann על הקמת 3D organotypic מלנומה-ספרואיד-העור-הדגם ומספקת פרוטוקולים מעולה. המחברים גם תודה שערותיו ארוכות ואפורות בוש לתמיכה טכנית יקרי ערך. העבודה נתמכה על ידי BMBF e: תוכנית לרפואה 031A423A "מלנומה רגישות".

כל רקמה אנושית העבודה בוצעה באמצעות פרוטוקולי המוסדי שאושר.
1. הפרדה בין דרמיס לאפידרמיס של העור האנושי (ילדותי עורלה ברית מילה)
<ol><li>למקם את העורלה (בדרך כלל 1-2 ס מ2) לתוך תבשיל תרבות תא סטרילי ללא דבק (Ø 10 ס מ), לכסות את זה עם 10-12 מ ל תמיסת באגירה פוספט+ (pH 7.2 מ מ CaCl2, 0.5 מ מ MgCl2, PBS = PBS+). הסר את כל הרקמות (אדיפוז) עודף באמצעות אזמל סטרילי וחדים.</li>
	<li>לחתוך את העור לחתיכות 3 מ מ x 5 מ מ, לשטוף אותם עם PBS, מעבירים לצלחת תרבות תא סטרילי ללא דבק (Ø 6 ס מ). מכסים את חתיכות רקמה עם 5-7 מ של dispase פתרון (2 U/mL ב- PBS). לאטום את המנה התרבות תאים עם סרט פרפין, תקופת דגירה של 16 h-4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>. משכי את עוריות מן החלק עורי עם מלקחיים סטרילי שני להעביר את חתיכות רקמה גזור תא בודד ללא דבק תרבות מנות (Ø 6 ס מ), לכסות את כל אחד מהם עם PBS+.</li>
</ol>2. בידוד של ראשי Keratinocytes מכל האפידרמיס
<ol><li>בזהירות להסיר את PBS+ המנה התרבות התא באמצעות פיפטה פסטר ולשטוף את חתיכות רקמות עוריות (סעיף 1.3) עם PBS. לחתוך את האפידרמיס לחתיכות קטנות יותר (1 מ מ2) ולאסוף אותם צינור חרוטי 50-mL. להוסיף 10 מ ל 1 x טריפסין-EDTA (טרופה עד 37 ° C), תקופת דגירה של 5 דקות באמבט מים בטמפרטורה 37 º C מערבולת המתלה רקמות כל 2 דקות.</li>
	<li>לעצור את התגובה אנזימטי על-ידי הוספת סרום עגל עוברי 1 מ"ל (FCS). Resuspend התאים על ידי pipetting למעלה ולמטה עם פיפטה פלסטיק 10-mL עבור 4 דק לנסות להימנע בועות וקצף היווצרות.</li>
	<li>Pipet התליה תא לתוך מסננת תא (נקבוביות בגודל 100 מיקרומטר), הממוקמת מעל צינור חרוטי מ"ל, ולשטוף 3 x 5 מ ל PBS. Centrifuge התאים ב g 200 x עבור 5 דק Resuspend בגדר תא 2-6 מ"ל תרבות בינוני המכיל 1% (v/v) gentamycin. לקבוע את מספר התא באופן ידני על ידי תאים ספירה תאים 6 x 105 hemocytometer וזרע לתוך בקבוקון תרבות T75 התא.</li>
</ol>3. טיפוח Keratinocytes ראשי
<ol><li>דגירה keratinocytes העיקרי מבודד בשלב 2.3 בחממה תא-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 בינוני תקין ללא FCS, כדי confluency 50-70%.</li>
	<li>את המעבר של keratinocytes בזהירות להסיר את המדיום, הוסף 5 מ ל PBS-EDTA, דגירה התאים 10 דקות ב 37 º C. לבדוק אם התאים החלו להתנתק מן הבקבוק תרבות תחת מיקרוסקופ אור (4 X הגדלה: תאים יופיע מעוגל אך עדיין מחוברים!). אם לא, להחליף PBS הישן-EDTA PBS טריים-EDTA, מחדש תקופת דגירה של עוד 10 דקות ב 37 º C.</li>
	<li>הוסף 5 מ ל 1 x טריפסין-EDTA לתאים מעוגל עדיין מכוסה 10 מ"ל PBS-EDTA ו מחדש דגירה אותם למשך 1-3 דקות ב 37 º C. לעצור את התגובה אנזימטי על-ידי הוספת 1 מ"ל FCS ולאסוף את התאים מנותקת צינור חרוטי 50-mL. Centrifuge התאים ב- g x 200 עבור 5 דקות, resuspend בגדר תקין בינונית, ואת הזרעים 6 x 105 תאים לתוך בקבוקון תרבות טריים T75 התא. הערה: כדי ליצור organotypic העור בנייה, keratinocytes העיקרי אמור לשמש לא יאוחר מאשר ממעבר 3-4.</li>
</ol>4. בידוד של Fibroblasts העיקרי של הדרמיס
<ol><li>לחתוך את הרקמה עורי (סעיף 1.3) לחתיכות קטנות יותר (1 מ מ2) ולהעביר אותם לתוך צינור חרוטי 50-mL. להוסיף 10 מ ל collagenase-פתרון (5 U/mL ב- PBS+), תקופת דגירה של 45 דקות באמבט מים בטמפרטורה 37 º c Centrifuge התערובת של חתיכות רקמות ותאים ב g x 200 במשך 5 דקות.</li>
	<li>לשטוף את צניפה תא פעמיים עם 10 מ"ל DMEM המכילה גלוקוז 4.5 g/L וגלוטמין, אך ללא L-פירובט. סוף סוף resuspend את חתיכות רקמה ב 2 מ של DMEM המכיל 1% (v/v) gentamycin ו- 10% FCS. להעביר אותם לתוך בקבוקון תרבות תא T25, דגירה אותם בתוך חממה תא-CO של 37 ° C ו- 5%-2 בלילה. הערה: אמצעי האחסון קטן מאפשר את fibroblasts להגר ההריסות הרקמות, מכריח אותם כדי לצרף הבקבוקון תרבות.</li>
	<li>למחרת בבוקר, להוסיף עוד 6 מ ל DMEM/Gentamycin/FCS, תקופת דגירה של 2-3 ימים ב 37 ° C עד התאים הגיעו 80-90% confluency.</li>
</ol>5. טיפוח Fibroblasts ראשי
<ol><li>המעבר של fibroblasts, להסיר את המדיום ולשטוף תאים חסיד עם PBS. הוסף 5 מ ל 1 x טריפסין-EDTA דגירה למשך 3 דקות ב 37 º C.</li>
	<li>לעצור את התגובה אנזימטי על-ידי הוספת 5 מ"ל DMEM/FCS ולאסוף את התאים מנותקת צינור חרוטי 50-mL. Centrifuge התאים ב- g x 200 עבור 5 דקות, resuspend בגדר DMEM בינוני, זרע 6 x 105 תאים לתוך בקבוקון תרבות טריים T75 התא. הערה: כדי ליצור organotypic העור בנייה, fibroblasts העיקרי אמור לשמש לא יאוחר מאשר מעבר 4-6.</li>
</ol>6. דור של מלנומה 3D Spheroids באמצעות שיטת טיפה תלוי
<ol><li>תרבות בתאי מלנומה (למשל, 451-לו או כל קו תא מלנומה עניין) על פי כללי פרוטוקולים, באמצעות RPMI המכיל 10% FCS15.<ol>
<li>כדי להפיק מלנומה spheroids של גודל ואיכות דומים, לשטוף את תאי מלנומה PBS, הוסף 5 מ של 1 x טריפסין-EDTA ב- PBS תאים T175 תא תרבות הבקבוק ולאחר תקופת דגירה של 3-5 דקות בטמפרטורת החדר (RT). לנטרל את טריפסין על-ידי הוספת 5 מ"ל RPMI/10% FCS. קציר שהתאים על ידי צנטריפוגה-g 200 x עבור 5 דק להשעות מחדש בגדר תא ב RPMI/FCS-ריכוז סופי של תאים למ"ל 10,000 כפי שנקבע על ידי בבניינים של hemocytometer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>במקום 40 x 25 µL (= 250 תאים) של התליה תא על גבי המשטח הפנימי של המכסה לצלחת תרבות תא ללא דבק סטרילי (Ø 10 ס מ) בעזרת פיפטה מרובה אלקטרונית. עם תנועה מהירה אך חלקה, תסובב את המכסה ומניחים אותו על המנה התרבות תאים המתאימים המכיל 5 מ"ל PBS.<ol>
<li>תרבות "מחזיקה טיפה מנות" חממה תא-CO של 37 ° C ו- 5%-2 10-14 ימים, בהתאם לסוג התא המשמש. הערה: התאים משלב הצמיחה MM בדרך כלל לגדול מהר יותר, בצורה יותר חזקה spheroids הטיפה לתלייה לעומת בתאי מלנומה נגזר על RGP או VGP. להערכת בודדים, להתבונן ספרואיד צמיחה תחת משקפת או תחת מיקרוסקופ אור (4 X הגדלה). בדרך כלל, spheroids הופכים לזיהוי לאחר 48 שעות תחת משקפת או תחת מיקרוסקופ אור (4 X הגדלה). אחרי 10-14 ימים, הם גלויים ללא כל מכשיר ההגדלה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>5 ימים לאחר סיכוייכם טיפה הראשונית, להוסיף 10 µL בינוני RPMI/10% FCS טריים כל טיפה. לאחר מכן, חילופי µL 10 בינוני בכל יום אחר. השימוש של מתקן אלקטרוני שימושי מאוד בשלב זה.</li>
	<li>בהתאם לסוג התא, לקצור את spheroids (ראה סעיף 10 לפרטים) לאחר 10-15 ימים בהדחה בעדינות המכסה תא תרבות צלחת עם PBS. לאסוף אותם בקערה התרבות התא ללא דבק טריים. הערה: תקופת טיפוח-תרגול תלוי שלב הצמיחה גידול של תאי מלנומה כאשר הם נשאבו בתחילה, למשל, spheroids שמקורם תאים 451-לו לגדול כ-500 מיקרומטר בקוטר בתוך 12 ימים culturing בתיבה הנפתחת תלויה15 .</li>
</ol>7. דור של תא עורי עור מלא Organotypic משחזר
<ol><li>ליצור מודלים העור באמצעות 24-ובכן תא נקבובי ממברנה מוסיף (הנקבוביות גודל 8 מיקרומטר) להציב לוחות 24-. טוב. הערה: ודא שלא לעשות שימוש תלוי אבל עומד מוסיף, כי הם ימוקמו על פלטה 6-ובכן לטיפוח אוויר נוזלי בשלב מאוחר יותר.</li>
	<li>הכינו את הפתרון (GNL) ניטרול ג'ל15, כמו גם התקשורת תרבות המכונה מ"מ ו16,צמיחה אנדותל מדיה (EGM)17. כדי למנוע קרישת דם, חנות הקולגן מסוג I (בדרך כלל מזנב החולדה, 3.5-4 מ ג/מ ל חומצה אצטית N 0.02 נקודות) על הקרח עד השימוש, כי זה מתחיל להתחבר ב- RT.</li>
	<li>להשעות מחדש עונה 1 פרק 10 fibroblasts5 לכל הוספה ב GNL ומערבבים במהירות התליה תא עם קולגן ביחס של 1:3 באמצעי אחסון הסופי של µL 500/הוספה. מיקס על ידי בעדינות pipetting למעלה ולמטה כדי למנוע היווצרות בועה כמו בועות עשוי לפגום באיכות העור לשחזר.</li>
	<li>לאפשר את ג'לים עורי בודדים להתיישב על ידי שמירה אותם בלי בינוני ב RT למשך 30 דקות בשכונה סטרילי. לאחר מכן מכסים כל ג'ל עם DMEM המכילה גלוקוז 4.5 g/L, 1%-גלוטמין, 10% FCS, וללא L-פירובט, דגירה בין לילה ב 37 º C.</li>
</ol>8. דור של התא באפידרמיס של עור מלא Organotypic משחזר
<ol><li>למחרת להסיר את המדיום ג'לים עורי, equilibrate אותם עם המדיה EGM (FCS 10%, 1% PenStrep, גנטמיצין 10 מ"ג/מ"ל) עבור 2 h ב- 37 מעלות צלזיוס. למשוך את המדיום, בזהירות זרע keratinocytes5 עונה 1 פרק 10 resuspended ב 100 µL EGM על גבי הג'ל עורי.</li>
	<li>דגירה של בנייה עבור 1.5 h ב 37 ° C כדי לאפשר את keratinocytes לדבוק תא עורי. הערה: במהלך תקופה זו דגירה, ג'לים יתחילו להתכווץ עקב התכווצות פיברובלסט-induced, לפיכך, לפחות באופן חלקי ניתוק מהקירות הוספה.</li>
	<li>מכסה את העור מקבילות עם 800 µL EGM, הסר בזהירות את הג'ל שיורית מהקיר הוספה עם טיפ קטן פיפטה (לבן). תרבות של מקבילות העור שקועים EGM למשך 7 ימים חממה תא ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2, ולשנות את המדיום בכל יום אחר. הערה: במהלך תקופה זו העור מקבילות יתכווץ באופן משמעותי.</li>
</ol>9. אוויר נוזלי טיפוח העור מלא Organotypic משחזר
<ol><li>יום 8, העברת כל הכנס טוב בודדים של צלחת 6-. טוב. רק להוסיף מ ל 1.2-1.4 מ מ בינוני כל טוב, כך בנייה מחדש העור מסופק עם מדיום מתחתית הבאר אך אינו מכוסה בינונית. הערה: את הטיפוח הממשק אוויר נוזלי מאפשר ריבוד של חלק באפידרמיס, הקמת שכבה cornified מלא (הקרנית).</li>
	<li>במהלך הימים 10-17, לשנות את המדיום כאמור בסעיף 9.1 בכל יום אחר. במהלך תקופה זו, להוסיף תרופות או גירויים אחרים לפי הצורך כדי המדיום. הסר בזהירות את בנייה מחדש של העור מלא מהמכסה נקבובי ממברנה בעזרת פינצטה מעוקל לניתוח נוסף, למשל, ניתוח immunohistochemical (איור 1).</li>
</ol>10. דור של הדגמים העור מלנומה Organotypic ספרואיד
<ol><li>כדי לשלב את spheroids מלנומה לתוך תא עורי של בנייה מחדש העור מלא organotypic, בזהירות לשטוף את spheroids (לאחר שלב 6.4) המכסה של התליה טיפה תא תרבות תבשיל עם PBS. לאסוף 10-20 spheroids/להוסיף לצלחת תרבות עקרה תא ללא דבק. הסר בזהירות PBS מוגזמת עם פיפטה פסטר.</li>
	<li>מחוק לגמרי את spheroids ביותר האפשרי הקטן ביותר של אמצעי האחסון של EGM. בשלב הזה לצפות ולספור את spheroids בעין בלתי מזוינת, ללא מכשיר ההגדלה נוספות. לקחת 10-20 spheroids לכל עור דגם/ג'ל, כאמור בשלב 10.1.</li>
	<li>העברתם לאמצעי האחסון הרצויה של GNL המכילה fibroblasts (במהלך שלב 7.3), מערבבים עם סוג הקולגן. מהשלב הזה על המשך כמתואר בסעיפים 7.3-9.1. הערה: גידול spheroids לנראה הג'ל עורי כמו כתמים לבנים (איור 2)</li>
</ol>

<ol>
	<li>Boulais, N., Misery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermis:+a+sensory+tissue.">The epidermis: a sensory tissue.</a> Eur. J. Dermatol. 18 (2), 119-127 (2008).</li><li>Blanpain, C., Fuchs, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epidermal+homeostasis:+a+balancing+act+of+stem+cells+in+the+skin.">Epidermal homeostasis: a balancing act of stem cells in the skin.</a> Nat.Rev. Mol. Cell Biol. 10 (3), 207-217 (2009).</li><li>Shain, A. H., Bastian, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+melanocytes+to+melanomas.">From melanocytes to melanomas.</a> Nat. Rev. Cancer. 16 (6), 345-358 (2016).</li><li>Clark, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+cutaneous+malignant+melanoma+as+a+model+for+cancer.">Human cutaneous malignant melanoma as a model for cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 10 (2), 83-88 (1991).</li><li>Hsu, M. Y., Meier, F., Herlyn, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma+development+and+progression:+a+conspiracy+between+tumor+and+host.">Melanoma development and progression: a conspiracy between tumor and host.</a> Differentiation. 70 (9-10), 522-536 (2002).</li><li>Miller, A. J., Mihm, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanoma.">Melanoma.</a> N. Engl. J. Med. 355 (1), 51-65 (2006).</li><li>Balch, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Final+version+of+2009+AJCC+melanoma+staging+and+classification.">Final version of 2009 AJCC melanoma staging and classification.</a> J. Clin. Oncol. 27 (36), 6199-6206 (2009).</li><li>Eigentler, T. K., Caroli, U. M., Radny, P., Garbe, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Palliative+therapy+of+disseminated+malignant+melanoma:+a+systematic+review+of+41+randomised+clinical+trials.">Palliative therapy of disseminated malignant melanoma: a systematic review of 41 randomised clinical trials.</a> Lancet Oncol. 4 (12), 748-759 (2003).</li><li>Kim, T., Amaria, R. N., Spencer, C., Reuben, A., Cooper, Z. A., Wargo, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combining+targeted+therapy+and+immune+checkpoint+inhibitors+in+the+treatment+of+metastatic+melanoma.">Combining targeted therapy and immune checkpoint inhibitors in the treatment of metastatic melanoma.</a> Cancer Biol. Med. 11 (4), 237-246 (2014).</li><li>Lawrence, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutational+heterogeneity+in+cancer+and+the+search+for+new+cancer-associated+genes.">Mutational heterogeneity in cancer and the search for new cancer-associated genes.</a> Nature. 499 (7457), 214-218 (2013).</li><li>Flaherty, K. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+mutated,+activated+BRAF+in+metastatic+melanoma.">Inhibition of mutated, activated BRAF in metastatic melanoma.</a> N. Engl. J. Med. 363 (9), 809-819 (2010).</li><li>Rauschenberg, R., Garzarolli, M., Dietrich, U., Beissert, S., Meier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systemic+therapy+of+metastatic+melanoma.">Systemic therapy of metastatic melanoma.</a> J. Dtsch. Dermatol. Ges. 13 (12), 1223-1235 (2015).</li><li>Kunz-Schughart, L. A., Freyer, J. P., Hofstaedter, F., Ebner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+3-D+cultures+for+high-throughput+screening:+the+multicellular+spheroid+model.">The use of 3-D cultures for high-throughput screening: the multicellular spheroid model.</a> J. Biomol. Screen. 9 (4), 273-285 (2004).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).</li><li>Vorsmann, H., Groeber, F., Walles, H., Busch, S., Beissert, S., Walczak, H., Kulms, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+human+three-dimensional+organotypic+skin-melanoma+spheroid+model+for+in+vitro+drug+testing.">Development of a human three-dimensional organotypic skin-melanoma spheroid model for in vitro drug testing.</a> Cell Death. Dis. 4, e719 (2013).</li><li>Chen, C. S., Lavker, R. M., Rodeck, U., Risse, B., Jensen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+a+serum-free+epidermal+culture+model+to+show+deleterious+effects+of+epidermal+growth+factor+on+morphogenesis+and+differentiation.">Use of a serum-free epidermal culture model to show deleterious effects of epidermal growth factor on morphogenesis and differentiation.</a> J. Invest. Dermatol. 104 (1), 107-112 (1995).</li><li>Meier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoma+progression+in+skin+reconstructs+:+biological+significance+of+bFGF.">Human melanoma progression in skin reconstructs : biological significance of bFGF.</a> Am. J. Pathol. 156 (1), 193-200 (2000).</li><li>Sinnberg, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+PI3K-AKT-mTOR+signaling+sensitizes+melanoma+cells+to+cisplatin+and+temozolomide.">Inhibition of PI3K-AKT-mTOR signaling sensitizes melanoma cells to cisplatin and temozolomide.</a> J. Invest. Dermatol. 29 (6), 1500-1515 (2009).</li><li>Niessner, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+farnesyl+transferase+inhibitor+lonafarnib+inhibits+mTOR+signaling+and+enforces+sorafenib-induced+apoptosis+in+melanoma+cells.">The farnesyl transferase inhibitor lonafarnib inhibits mTOR signaling and enforces sorafenib-induced apoptosis in melanoma cells.</a> J. Invest. Dermatol. 131 (2), 468-479 (2011).</li><li>Foty, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+hanging+drop+cell+culture+protocol+for+generation+of+3D+spheroids.">A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids.</a> J. Vis. Exp. (51), e2720 (2011).</li><li>Hirschhaeuser, F., Menne, H., Dittfeld, C., West, J., Mueller-Klieser, W., Kunz-Schughart, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicellular+tumor+spheroids:+an+underestimated+tool+is+catching+up+again.">Multicellular tumor spheroids: an underestimated tool is catching up again.</a> J. Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).</li><li>Lin, R. Z., Chang, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+three-dimensional+multicellular+spheroid+culture+for+biomedical+research.">Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research.</a> Biotechnol. J. 3 (9-10), 1172-1184 (2008).</li></ol>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

Organotypic מלנומה ספרואיד עור דגם הציג כאן צווי תובנות חדשות על הבנה עמוקה יותר של אינטרה-tumoral ואינטראקציה הגידול-מארח, ואשר עשוי לספק פלטפורמה סינון מתקדם כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של התפתחות גידולים, ההתנגדות טיפול בעתיד.
כדי להבטיח את הטוב ביותר הפיזיולוגיות ויוו לחקות תנאי העור משחזר, האיכות של התאים הראשי הוא בעל חשיבות עליונה. כאמור לעיל, תאי העור קטין או טרום לידתית להראות בכיתה התמיינות הנמוכה ביותר, לכן המתאימים ביותר ליצור מקבילות מלא-עובי העור. בקרת האיכות אפשרי הראשון הוא מידת התכווצות עורי-יום 2 לאחר זריעה של keratinocytes, equilibrating את הג'ל על EGM (פרוטוקול סעיפים 8.2 ו- 8.3). ג'לים עורי יתכווץ ביותר עם האיכות הטובה ביותר של fibroblasts. כמו כן, השילוב של fibroblasts מעט מדי או יותר מדי עשוי לפגום עורי להתכווצות כתוצאה מכך הקובץ המצורף באפידרמיס תא עורי. זה בתורו תסכן את הבידול באפידרמיס, כי תהליך זה דורש מקיף צולבות לדבר בין עורי וכן תאים.
האיכות של ראשי תאים תלויה גם באופן ביקורתי את confluency תא, כמו גם המעבר של התאים. אם keratinocytes הם מגדלים כדי ≥80% confluency הם מיד להפסיק מתרבים ולהתחיל להבחין. לכן חשוב תרבות אותם כדי confluency 40-70% במהלך passaging, ולהשתמש בהם לא יאוחר מעבר 3-4. Fibroblasts פחות רגישים, אך אין להשתמש מאוחר יותר מאשר מעבר 4-6. אנא שימו לב כי כל ראשי תאים, שורות תאים המשמשת ליצירת organotypic מלנומה ספרואיד העור מודלים מתורבתים בחינם של אנטיביוטיקה, ולכן הסיכון לזיהום הוא גבוה. עם זאת, התוספת של אנטיביוטיקה משנה את הפיזיולוגיה של תאים נפרדים, ולפיכך מפחית את טיב המקבילים העור.
באופן כללי, הגידול ספרואיד היווצרות אפשרי מפני כמעט כל מיני שורות תאים סרטניים וגם מתאי הגידול מבודד טריים מן החומר המטופל. תא הראשונית מספר ו/או טיפוח הזמן להשגת גדלים ספרואיד אופטימלית עשוי להשתנות בהתאם לסוג התא המשמש. עד גודל של 150-200 מיקרומטר, כל התאים הכלולים ספרואיד יכול עדיין מספיק להנתן עם חומרים מזינים באמצעות דיפוזיה פשוטה. רק spheroids עם גדלי ≥500 מיקרומטר להראות דרגת התמיינות גבוהה ומייצגים תכונות אופייניות של רקמת הגידול הלא-vascularized22.
Organotypic מלנומה-ספרואיד-העור-המודל פותח כאן זה מתאים במיוחד ללמוד אינטראקציות הגידול-פונדקאי ועבור בדיקות תחת in vivoסמים מלנומה-כמו תנאים15. . עדיין, הסביבה של מלנומה ויוו הוא אפילו יותר מורכב, מחסה מגוון רחב של סוגי תאים סרטניים הקשורים, כולל תאים חיסוניים ותאי אנדותל. מאז התוספת של נאות תאים חיסוניים הראשי פונה בעיות histocompatibility, מודלים אלה עדיין אינם מסוגלים לעקוב כראוי אחר גישות טיפוליות-החיסון.
ובכל זאת, מלנומה spheroids יכול להיווצר מחומר מבודד טרי החולה, ברגע כלול בתוך בנייה מחדש עור מלא, עשוי לשמש סמים בודדים הקרנת פלטפורמות. גם השילוב של חתיכות של גרורות סרטן העור לתוך העור בנייה הוא מתקבל על הדעת לנסות שילובים תרופתיים בגישה טיפולית מותאמת. כולל דגם העור מלנומה organotypic התלת-ממד בבדיקת פרה סביר להבטיח כי רק המבטיחים ביותר הרומן טיפולית המושגים נלקחים קדימה ניסויים קליניים, ובכך להקטין את השחיקה של טיפולים פוטנציאליים חדשים בשביל זה המחלה, הגדלת שיעור ההצלחה הטיפולית בניסויים קליניים.

העור האנושי מורכב שני תאים נפרדים לשרת פונקציות שונות בהגנה על הגוף מפני השפעות סביבתיות שליליות1. תא עורי התחתון מורכב רקמת חיבור fibro-אלסטי. הוא מורכב של סיבי קולגן ואלסטין מחוברים באופן רופף מסונתז על ידי fibroblasts, משרת פונקציה מחסום מכני. הדרמיס מופרד האפידרמיס העליון על ידי הנדן הבזליים אשר מופק כמו מטריצה חוץ-תאית בשל תקשורת מתמדת בין שני תאי העור. בניגוד הדרמיס, האפידרמיס אפיתל קשקשיים אשר מורכב בעיקר keratinocytes, יכול להיות מובחן ארבע שכבות. הרובד basale מורכב מובחן keratinocytes הבזליים אשר נובעות כל הזמן העור ובתאים stratifying דרך השלבים של הרובד קוצנית , הרובד granulosum לתוך stratum corneum כדי להגן על הגוף מפני התייבשות וזיהומים2. מלנוציטים מיושרים של קרום הבסיס, ולתקשר באמצעות הרחבות דנדריטי עם keratinocytes מרובים. הם מייצרים מלנין הפיגמנט כדי להגן על רקמות העור מפני ההשפעות השליליות של קרינת UV, כמו הזדקנות העור, החיסוני, דלקת, אינדוקציה של סרטן עור שאינו מלנומה. התרומה קרינה UV הטרנספורמציה של מלנוציטים כדי מלנומה ממאירה, אולם הוא עדיין תחת הדיון3.
התפתחות מלנומה הבדיל לשלבים התקדמות הגידול שונים, המאופיינת על ידי שינויים גנטיים, מורפולוגיות, היסטולוגיים מסויימים4. הם מקורם גם דה נובו או של נקודת חן מולדת או נרכשת עקב מקומי עלייה של התפשטות מלנוציט גורם neoplasia שפיר. את הפציעה קודמן עשוי להמיר לתוך רקמות dysplastic מבנית ששונה המכיל תאים atypic, אשר עלולה להמשיך ממאיר בשלב הראשון, שלב הצמיחה רדיאלי (RGP). בשלב מוקדם זה התקדמות הגידול מאופיין על ידי תאים מתרבים בצורה רדיאלית בתוך האפידרמיס, מציג כמה תאים באופן מקומי פולשנית בתוך הדרמיס papillary. במהלך מלנומה שלב (VGP) עוקבות גדילה אנכי תאים הצגה כבר הפנוטיפ גרורתי ופולשני לעבור דרך הנדן הבזליים לחדור בחלק העמוק של הדרמיס, כמו גם את הרקמה התת עורית5. לבסוף, מלנומה גרורתית (MM) מייצג את הבמה התקדמות האגרסיביים ביותר עם תאים גרורתי מערכתית מתפשטת ברחבי מערכת הדם והלימפה לפלוש יש איברים כמו הכבד, הריאות, המוח6.
עד כה, אבחון מוקדם ולאחריו ניתוח נשאר עדיין הטיפול היעיל ביותר של מלנומה ממאירה. הפרוגנוזה של חולים עם גרורות רחוקות, עם זאת, עדיין גרועות במיוחד7, כי משטרי כימותרפיה קלאסית להתייעץ רק קצת הישרדות תועלת8,9. עם זאת, לאחר עשרות שנים של קיפאון, התפתחויות אחרונות טיפולים ממוקדים במידה ניכרת שיפרו את סיכויי ההחלמה של מלנומה ממאירה.
Dysregulation של שני מסלולים עיקריים mitogen מופעל, את ראס-RAF-MEK-טיפשה, את PI3K-AKT-PTEN איתות המסלולים, להציג את מניעי מפתח של מלנומה התקדמות, במיוחד כאשר צורונים הפעלת נקודת מוטציות של BRAFV600 proto-oncogenes, NRAS הם מתנה10. בהתאם לכך, ההמצאה של מעכבי קינאז יישוב הבטיח תועלת טיפולית לחולים הסובלים מלנומה גרורתית. מספר רב של ניסויים קליניים שנערכו לנקודה זו לא השיגה יתרון משמעותי עבור חולים עם מלנומה גרורתית. כמעט כל התגובות הן חלקיות, עם subpopulation של חולים מציג התנגדות ראשי. יתר על כן, הרכישה של התנגדות משני המובילים שמפסיק נצפתה ברוב המכריע של חולים11,12.
מתברר כי ניתוח של המצב מוטציה לבד אינה מספיקה כדי לפתח את האסטרטגיה הטיפולית החזק ביותר. כלי אבחון חדשים מהירה ואמינה נחוצים לתעד ולנתח באופן שיטתי את יכולת התגובה של התאים הסרטניים בודדים. הרוב המכריע של נתונים זמין כרגע על מלנומה אנושית הושגו מתרבויות תא מלנומה (2D) דו מימדי. תאים סרטניים, עם זאת, גדל ב- 3D לאפשר crosstalk המערכת בין סרטן הבדיל תא subpopulations, כמו גם בין תאים סרטניים ואת הרקמה הלא-טרנספורמציה מארח שמסביב. לכן, זה יהיה הכי טוב לשחזר את סביבת 3D שבו פותח מלנומה, כדי לשמש הקרנה פרה דגם13,14.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="625">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">fetal serum albumin (FCS)</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">10270106</td>
			<td style="width:167px;">add 10 % to cell culture medium</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">25300054</td>
			<td>1X dilute in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">RPMI</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">61870010</td>
			<td style="width:167px;">for cultivation of melanoma cell lines</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">41965062</td>
			<td style="width:167px;">for cultivation of primary fibroblasts</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dispase</td>
			<td style="width:123px;">Gibco life technologies&#160;</td>
			<td>17105041</td>
			<td>2U/ml, dissolve in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Collagen type I</td>
			<td style="width:123px;">BD Biosciences</td>
			<td>354249</td>
			<td style="width:167px;">usually from rat tail, concentration should be 3.5-4 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">24-well inserts Nunclon&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Nunc</td>
			<td>140629</td>
			<td style="width:167px;">8 &#181;m pore size; use standing, not hanging inserts!</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">cell strainer</td>
			<td style="width:123px;">BD Falcon</td>
			<td style="width:119px;">352360</td>
			<td>yellow</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Gentamycine</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15750060</td>
			<td>dissolve in PBS</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Keralife keratincyte medium</td>
			<td style="width:123px;">Cell Systems</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">do not add FCS or antibiotics</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagenase</td>
			<td style="width:123px;">SERVA</td>
			<td>17454</td>
			<td>NB4 standard grade</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">juvenile human keratinocytes</td>
			<td style="width:123px;">Cell Systems</td>
			<td style="width:119px;">FC-0007</td>
			<td style="width:167px;">alternative to own preparation from juvenile foreskin</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">juvenile human fibroblasts</td>
			<td style="width:123px;">Cell Systems</td>
			<td style="width:119px;">FC-0001</td>
			<td style="width:167px;">alternative to own preparation from juvenile foreskin</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">DMEM 
			[+] 4,5 g/l Glucose, 
			[+] L- Glutamine, 
			[-] L- Pyruvate</td>
			<td style="width:123px;">Gibco life technologies</td>
			<td style="width:119px;">41965</td>
			<td style="width:167px;">mix 1:1 with Ham&#180;s F-12 for MM medium;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160; mix 3:1 with Ham&#180;s F-12 for EGM medium</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Ham&#180;s F-12 [+] L-Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">Gibco life technologies</td>
			<td style="width:119px;">&#160;21765-029</td>
			<td style="width:167px;">add to DMEM for the generation of EGM and MM medium (see lane 15)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">EGF&#160;</td>
			<td style="width:123px;">Gibco life technologies</td>
			<td style="width:119px;">&#160;13247-051</td>
			<td style="width:167px;">add 10 ng/ml only for the generation of EGM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Calcium chloride</td>
			<td style="width:123px;">Merck Chemicals</td>
			<td style="width:119px;">2381</td>
			<td style="width:167px;">add 1.9 mM for the generation of EGM and 3.8 mM for MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Selenic acid</td>
			<td style="width:123px;">Alfa Aesar</td>
			<td style="width:119px;">18851</td>
			<td style="width:167px;">add 53 nM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Insulin</td>
			<td style="width:123px;">Lilly</td>
			<td style="width:119px;">HI0219 Hum Pen 3ml 100 E.I./ml</td>
			<td style="width:167px;">add 5 &#181;g/ml for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Ethanolamine</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">E-0135</td>
			<td style="width:167px;">add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">P-Ethanolamine</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-0503</td>
			<td style="width:167px;">add 0.1 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Holo-Transferrine</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">T-0665</td>
			<td style="width:167px;">add 5 &#181;g/ml for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Triiodthyronine</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">T-6397</td>
			<td style="width:167px;">add 20 pM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H-088816</td>
			<td style="width:167px;">add 0.4 &#181;g/ml for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Progesterone</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P-8783</td>
			<td style="width:167px;">add 10 nM only for the generation of EGM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hepes</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">H-3784</td>
			<td style="width:167px;">add 15 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Serine</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S-4311</td>
			<td style="width:167px;">add 1 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Cholinchloride</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">C-7017</td>
			<td style="width:167px;">add 0.64 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">dFCS</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">F-0392 Lot 086K0361</td>
			<td style="width:167px;">add 2 % for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Adenine</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich&#160;</td>
			<td style="width:119px;">A-9795</td>
			<td style="width:167px;">add 0.18 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:123px;">PromoCell</td>
			<td style="width:119px;">C-42209</td>
			<td style="width:167px;">add 7.25 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Strontiumchloride</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">255521</td>
			<td style="width:167px;">add 1 mM for the generation of EGM and MM medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti cytokeratin 10 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">M7002</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti cytokeratin 14 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-53253</td>
			<td>1:200</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">&#160;anti laminin 5 antibody</td>
			<td style="width:123px;">Santa Cruz</td>
			<td style="width:119px;">sc-32794</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">anti filaggrin antibody</td>
			<td style="width:123px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">MA5-13440</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">anti involucrin antibody</td>
			<td style="width:123px;">Acris Antibodies</td>
			<td style="width:119px;">AM33368PU</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">secondary polyclonal goat anti-mouse IgG FITC labeled</td>
			<td style="width:123px;">LifeSpan Biosciences</td>
			<td>LS-C153907</td>
			<td>1:50</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">secondary polyclonal goat anti-mouse IgG Cy3 labeled</td>
			<td style="width:123px;">Jackson Immuno Research</td>
			<td style="width:119px;">115-165-003</td>
			<td>1:1000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DAPI</td>
			<td style="width:123px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10236276001</td>
			<td>1:100</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a 3d organotypic melanoma spheroid skin model

שינוי ממאיר של מלנוציטים, תאי פיגמנט העור האנושי, גורם להיווצרות מלנומה, סרטן אגרסיבי ביותר עם פוטנציאל גרורתי מוגברת. לאחרונה, מונו-chemotherapies להמשיך לשפר על ידי טיפולים שילוב ספציפי מלנומה עם מעכבי קינאז יישוב. . עדיין, מלנומה גרורתית נשאר מחלה מסכנת חיים בגלל גידולים להפגין התנגדות ראשי או לפתח עמידות לטיפולים חדשניים, ובכך החזרת יכולת tumorigenic. על מנת לשפר את ההצלחה הטיפולית של מלנומה ממאירה, הקביעה של המנגנונים המולקולריים היוועצות עמידות נגד גישות הטיפול הקונבנציונלי הוא נחוץ; עם זאת, זה דורש מודלים חדשניים הסלולר במבחנה . . כאן, אנחנו מציגים במבחנה organotypic תלת מימד (3D) מלנומה ספרואיד מודל יכולים להתחזות הארכיטקטורה ויוו של מלנומה ממאירה, עשוי להצדיק תובנות חדשות אינטרה-tumoral כמו גם הגידול-פונדקאי אינטראקציות. המודל משלב מספר מוגדר של הבדיל ובוגרת מלנומה spheroids במודל לשיקום עור תלת-ממד מלא המורכב של תאי העור העיקרי. המצב הרכב ובידול הסלולר של spheroids מלנומה מוטבע הוא דומה לזה של מלנומה עורית גרורות vivo בתוך. באמצעות מודל ספרואיד מלנומה זה organotypic כמו תרופה הקרנת פלטפורמה עשויים לתמוך הזיהוי המגיבים נבחר טיפולים משולבים, בעוד חוסך את הנטל טיפול מיותר עבור הלא-המגיבים, ובכך מגדיל את היתרון של התערבויות טיפוליות.

טיפול מוצלח של מלנומה גרורות שיכול להיות מושפע קרוס-השיחה בין תאים סרטניים, כמו גם בין גידול התאים המארחים שאינו משתנה. המטרה של פיתוח מודלים organotypic של סרטן במבחנה היא לספק מערכות פרה למבחן מסכם את הדברים את הארגון 3D והמורכבות של מלנומה אנושיים ויוו. דבר זה מאפשר חקר ההשפעה הטיפולית על הגידול בתוך סביבה organotypic ואת ההשפעות השליליות על הרקמה שמסביב הראשי במקביל.
כדי לפתח את הדגמים הטובים ביותר של עור organotypic, האיכות של התאים הראשי היא קריטית. זה יתרון לשימוש fibroblasts העיקרי לנוער keratinocytes, כי הם בדרך כלל פחות מובחנים בהשוואה לתאי העור העיקרי למבוגרים. לעור נעורים תאים באפשרותך להיות מבודד העורלה לנוער, כפי שמתואר בסעיפים פרוטוקול 1-5, אך ניתן גם לרכוש מחברות fibroblasts העיקרי טרום לידתית, keratinocytes. אם רכישת, יש צורך סדר התאים מתורמים שונים כדי להימנע מתוצאות תורם ספציפי, למשל, רגישות סמים. פרוטוקול כל מוצג כערכת באיור3.
בקרת איכות של תלת-ממד מלא-עור מקבילות דורש ניתוח immunohistochemical. ניתן לקבל רושם ראשוני Hematoxylin-אאוזין (H & E) צביעת פרפין משובצים קטעים (3 מיקרומטר). ניתוח מפורט של האיכות של בידול אפידרמיס ועל היווצרות הנדן הבזליים בין דרמיס לאפידרמיס דורש ניתוח immunohistochemical באמצעות נוגדנים ספציפיים נגד סמן ריבוד באפידרמיס. דבר זה מאפשר הבחנה בין מובחן, מאוד שגשוג תאים ממוקם קרוב קרום הבסיס מאוד הבדיל ואת keratinized תאים בחלק הקרנית דרך היווצרות של שכבות עוריות ברורים בין . כפי שמוצג על ידי צביעת החיסון-היסטולוגית (איור 4), התמיינות keratinocytes ברחבי האפידרמיס של יכולה להיות מושגת הדומה לעור רגיל: בעיקר את התאים מובחן מהשכבות אפידרמיס תחתון (הרובד basale , הרובד קוצנית) כתם חיובי עבור קרטין 14, בעוד תאים הבדיל יותר מן הרבדים העל הבזליים (שכבה granulosum ו הקרנית) כתם חיובי עבור קרטין 10 ו- involucrin. בהתאם לכך, filaggrin מכתים יכול רק להיות שנצפו בתאים מאוד הבדיל של הקרנית. והכי חשוב, laminin 5 צביעת מגלה כי פרופריה הבזליים נוצר להתחבר מבחינה פיזיולוגית של אפידרמיס תא עורי של בנייה מחדש עור מלאכותי. זה מוכיח כי microenvironment organotypic בתקשורת נוצר בתאי מלנומה מארח או spheroids עבור הפיזיולוגיות וניתוח pathophysiologic.
לצורך מלנומה והתרופות הקרנה, בתאי מלנומה יחיד גם ניתן לשלב לתוך הדרמיס של העור מלא מקבילות כדי לאפשר דה נובו מלנומה הקן היווצרות18,19. לכן, בתאי מלנומה בשילוב עם ראשי fibroblasts ביחס של 5:1, centrifuged ביחד ב 200 גרם x במשך 5 דקות, resuspended, GNL לפני ערבוב עם קולגן. כתוצאה מכך, קינים תא מלנומה יהוו באופן ספונטני בתוך התא עורי. הניסיון שלנו רק תאים של הגידול גרורתי שלב קינים נאותה הטופס, בהשוואה בתאי מלנומה של RGP או VGP15. אחד החיסרון העיקרי של סוגים אלה של המודלים היא העובדה כי המספר והגודל של מלנומה קנים שנוצר לא ניתן לחזות, והם עשויים להשתנות בין בודדות העור בנייה מחדש, ללא תלות כל טיפול. לדוגמה, תאים 1,000 נזרע לתוך תא עורי עלול לקבל 10 קינים המורכב תאים 100 או 100 קנים בהיקף של 10 תאים כל (איור 5). משתנים ביולוגיים אלה מציגים שלושה ליקויים: ראשית, המספר והגודל של מלנומה קנים יצרו צפויות; שנית, גרורות ויוו בדרך כלל גדולים יותר מלנומה קינים ולהציג מגוון אינטרה-tumoral מורכבים יותר; שלישית, בשל מוגבלות תוחלת החיים של הגידול-קן מודלים, וטיפול מאותחלת מוקדם, כתוצאה מכך אלא מעכב גידול תוצר במקום לגרום רגרסיה של קנים הגידול הקיימים.
כדי להתגבר על מודלים אלה-העור ספרואיד מלנומה organotypic מגבלות ניתן להפיק. מאת culturing מלנומה גרורתית 250 תאים בתלייה ירידה של 14 ימים20, spheroids reproducibly נוצרות המורכב של מלנומה קיימא תאים עם קוטר הסופי של-500 מיקרומטר מחקה ללא הצגת מבנה קומפקטי vascularized הגידול צמתים, מיקרו-גרורות, או בין-נימי מיקרו אזורים של גידולים מוצקים21,22. באופן כללי, כל קו תא מלנומה מתאימה לדור של spheroids באמצעות התליה בשיטת; עם זאת, תאים שמקורם מתקדם יותר גידול גרורתי שלבים טופס spheroids מוצק יותר בהשוואה שורות תאים שמקורם התקדמות בשלבים המוקדמים, למשל, RGP.
עבור כמה תאים, זה יתרון על היווצרות ספרואיד הנכונה להגברת צמיגות של התליה ירידה בינונית תרבות. זו יכולה להיות מושגת על ידי התוספת של 10-50% מתיל-תאית למדיום תרבות. לפתרון מתיל-תאית מניות, החיטוי 1.2 g מתיל-תאית יחד עם פס מגנטי מערבבים בבקבוק זכוכית 100 מ. להוסיף 100 מ ל טרופה (60 ° C) בינונית ומערבבים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ו- h עוד 1-2-4 מעלות צלזיוס. Centrifuge הפתרון מניות עבור 2 h ב 5,000 x g ולאחסן את תגובת שיקוע צמיגה ב 4 ° C עד השימוש.
אימות תקינה של העור מלא מלנומה ספרואיד מודלים מסופק על ידי העובדה כי מספר מוגדר של מלנומה יכול spheroids - לפחות מבחינה סטטיסטית - ניתן לשלב פיברובלסט עורי/הקולגן אני לגרדום-יום 1 של הבנייה דגם העור, המאפשר אותם לפתח במשותף במהלך התמיינות עוריות לעוד 25-27 ימים. ניתן לנתח את התשואה של spheroids ישירות לאחר זריעה, מכיוון spheroids מופיעים כתמים לבנים בתוך שקופים עורי ג'ל, ניתן לראות ללא כל מכשיר ההגדלה (איור 2). כתוצאה מכך, דגם תלת-ממד העור נוצר נמלים מלנומה בוגרת spheroids, שהיה בתרבית במבחנה עבור סכום כולל של-42 ימים, מציג את הרמה הגבוהה ביותר של אינטרה-tumoral תא בידול15.
H & E מכתים של המודל ספרואיד העור מלנומה חושף את המראה היסטולוגית ואת חלוקת תאי מלנומה spheroids דומה מאוד, לאחת vascularized שאינם מלנומה אנושית העור גרורות ויוו15 (איור 6 ). Subpopulations שני תאי מלנומה הם ניתן להבחנה ברורה בתנאים האלה: subpopulation proliferating היקפיים, subpopulation המרכזית בעיקר המורכב מצומק, מוות או תאים עם נמק, ויוצרים את מה שנקרא "נמק" מרכז. Immunohistochemically חי, מתרבים subpopulations ניתן להבחין באמצעות נוגדנים נגד דה מרקר התפשטות KI-67, ואילו תאים של המרכז נמק, ניתן לאבחן על ידי מכתים TUNEL15. הפיזור המסוים של הגידול תא subpopulations יש הצדקה לפי גודל ספרואיד (≥500 מיקרומטר), כתוצאה מחוסר חומרים מזינים וחמצן בחלק המרכזי שבו מצטברת פסולת קטבולי. בעקבות הפרוטוקול בתנאי כאן יאפשר את הדור של organotypic לשחזור ואמין עור בעובי מלא דגם עם מוטבע spheroids מלנומה אנושית המחקים גרורות העור מלנומה אנושית. יישומים של זה הדגם כלול בדיקות סמים, הקרנת רעלים, להשפיע על חומרים קוסמטיים או לייזר בטיפול על תוצר מלנומה, וטיפול.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig1.jpg"> איור 1 : טיפוח של בנייה מחדש של העור 3D organotypic שקוע בינונית ו- הממשק אוויר נוזלי. ביום 0 keratinocytes הראשי הם נזרע על גבי תא עורי המורכב fibroblasts הראשית מוטבע לתוך סוג הקולגן אני מטריקס. בנייה מחדש של העור 3D מעובד להישאר מתחת למים עם EGM למשך 7 ימים, ניתוק מהקיר הוספה והתחל מתכווץ. ביום 8 התוספות הן הועבר 6-ולס וטיפח בכל הממשק אוויר נוזלי כדי לאפשר ריבוד באפידרמיס. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig2.jpg"> איור 2 : מלנומה spheroids מוטבע לתוך תא עורי מופיעים כתמים לבנים. בזמן הכנת תא עורי של בנייה מחדש העור תלת-ממד, מספר מוגדר של מלנומה spheroids ניתן להוסיף את סוג הקולגן פיברובלסט מערבבים. ברגע הג'ל עורי יש מלנומה spheroids הופכים לגלויים כמו כתמים לבנים.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig3.jpg"> איור 3 : ערכת בניית דגם organotypic תלת-ממד העור. הסרת רקמת שומן דוגמית העור וחותכים אותו לחתיכות קטנות יותר. הדגירה עם פתרון dispase בין לילה ב 4 ° C מקלה את פרידתה של האפידרמיס הדרמיס. מבודד fibroblasts העיקרי keratinocytes צריך להיות מעובד בנפרד, שימוש בין המעבר 4-6 ו- 3-4, בהתאמה. לאחר מכן, הדור של דגם תלת-ממד העור ניתן להמשיך כמפורט בפרוטוקול. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig4.jpg"> איור 4 : בנייה מחדש של העור 3D organotypic הראה רמה בידול דומה לעור רגיל האנושית. שעוות פרפין קטעי עור מקבילות (א) העור האנושי בהשוואה נורמלי (B) היו מוכתמים עבור הביטוי של keratins 14 (אדום: λ nmex 554; λem 568 nm) ו- 10, involucrin (ירוק: λex 490 nm; λem 525 nm ), filaggrin (ירוק: λex 490 nm; λem 525 nm), ו- laminin 5 (ירוק: λex 490 nm; λem 525 nm), וניתח עם מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה. גרעין התא היו דמיינו מאת דאפי מכתים (כחול: λex 340 ננומטר; λem 488 ננומטר). Immunohistochemical בחינת תלת-ממד המלא-עובי העור מקבילות חשף נאות עוריות ריבוד ויוצרים שכבות נפרדות של האפידרמיס, כפי שניתן לראות עור אנושי רגיל. בעוד תאים באפידרמיס בשכבות הנמוכות צבעונית חיובי עבור קרטין 14, יותר הבדיל התאים משכבת הבסיס העל-הראה קרטין 10 involucrin מכתים. תאים מאוד קרוב הקרנית בא לידי ביטוי filaggrin. Laminin 5 מכתים מראה כי פרופריה הבזליים נוצרת להתחבר מבחינה פיזיולוגית של אפידרמיס תא עורי (לוח הנמוך). איור זה נלקח Voersmann. et al. 15 בעלי הרשאה. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig5.jpg"> איור 5 : לא ניתן לחזות את המספר והגודל של מלנומה בנוי באופן ספונטני קנים. היווצרות הקן מלנומה דה נובו בתא עורי עור מלא מקבילות יכולה להיות מושגת על ידי ערבוב מספר מוגדר של מלנומה תאים עם fibroblasts הראשי כדי להטביע את שני סוגי תאים בסוג הקולגן אני מטריקס. ניתן רק לנתח את המספר והגודל של מלנומה בנוי באופן ספונטני קינים של בנייה מחדש עור תלת-ממד מבוגר לאחר כ 21 ימים. כמו שתוארו של שני מדגמים (A) ו- (B), המספרים והגדלים של מלנומה קינים עשויים להשתנות בין בנייה בודדות העור. כתוצאה מכך, זה קשה כדי לאמת את המודלים האלה וגם כדי לחזות את ההשפעה הטיפולית. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57500/57500fig6.jpg"> איור 6 : מלנומה spheroids משולב לתוך העור מקבילות לסכם תכונות מפתח של מלנומה עורית האנושי גרורות. H & E צבעונית פרפין מקטעים של גידול spheroids מוטבע לתוך העור מקבילות חשף spheroids לחלוק תכונות מפתח עם vascularized שאינם מלנומה עורית האנושי גרורות ויוו. Subpopulations שני תאים ניכרים בבירור: subpopulation ההיקפיים מגורים וחדר מרכזי subpopulation בעיקר המורכב מצומק, מוות או תאים עם נמק, ויוצרים את מרכז "נמק". הפיזור של הגידול תא subpopulations מובטחת על ידי גודל ספרואיד. דמות זו שונתה מ. Voersmann et al. 15 בעלי הרשאה. <a href="/files/ftp_upload/57500/57500fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model at JoVE.com

A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת 3D organotypic מלנומה ספרואיד העור מודל recapitulates הן את הארכיטקטורה ואת multicellular המורכבות של איברים/גידול של ויוו , אבל באותו זמן מסתגלת שיטתית ניסיוני התערבות.

מודל העור מלנומה Organotypic 3D ספרואיד

Malignant transformation of melanocytes, the pigment cells of human skin, causes formation of melanoma, a highly aggressive cancer with increased ...

a-3d-organotypic-melanoma-spheroid-skin-model

Research

JoVE Journal

Cancer Research

15.6K Views.  TU-Dresden. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת 3D organotypic מלנומה ספרואיד העור מודל recapitulates הן את הארכיטקטורה ואת multicellular המורכבות של איברים/גידול של ויוו , אבל באותו זמן מסתגלת שיטתית ניסיוני התערבות.

Video: A 3D Organotypic Melanoma Spheroid Skin Model

Therapy Testing in a Spheroid-based 3D Cell Culture Model for Head and Neck Squamous Cell Carcinoma

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with or without surgery. While platinum-based chemotherapy regimens currently represent the gold standard in terms of efficacy and are given in the vast majority of cases, new chemotherapy regimens, namely immunotherapy are emerging. However, the response rates and therapy resistance mechanisms for either chemo regimen are hard to predict and remain insufficiently understood. Broad variations of chemo and radiation resistance mechanisms are known to date. This study describes the development of a standardized, high-throughput in vitro assay to assess HNSCC cell line&#39;s response to various therapy regimens, and hopefully on primary cells from individual patients as a future tool for personalized tumor therapy. The assay is designed to being integrated into the quality-controlled standard algorithm for HNSCC patients at our tertiary care center; however, this will be subject of future studies. Technical feasibility looks promising for primary cells from tumor biopsies from actual patients. Specimens are then transferred into the laboratory. Biopsies are mechanically separated followed by enzymatic digestion. Cells are then cultured in ultra-low adhesion cell culture vials that promote the reproducible, standardized and spontaneous formation of three-dimensional, spheroid-shaped cell conglomerates. Spheroids are then ready to be exposed to chemo-radiation protocols and immunotherapy protocols as needed. The final cell viability and spheroid size are indicators of therapy susceptibility and therefore could be drawn into consideration in future to assess the patients&#39; likely therapy response. This model could be a valuable, cost-efficient tool towards personalized therapy for head and neck cancer.

We describe the evolution of a spheroid-based, three-dimensional in vitro model that enables us to test the current standard of experimental therapy regimens for head and neck squamous cell carcinoma on cell lines, aiming at evaluating therapy susceptibility and resistance on primary cells from human specimens in the future.

טיפול בדיקות במודל תרבות המבוסס ספרואיד Cell תלת-ממד עבור קרצינומה של תאים קשקשיים בצוואר ואחראי

Current treatment options for advanced and recurrent head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) enclose radiation and chemo-radiation approaches with ...

Identification, Histological Characterization, and Dissection of Mouse Prostate Lobes for In Vitro 3D Spheroid Culture Models

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate cancer (PCa). Understanding the anatomy and histology of the mouse prostate is important for the efficient use and proper characterization of such animal models. The mouse prostate has four distinct pairs of lobes, each with their own characteristics. This article demonstrates the proper method of dissection and identification of mouse prostate lobes for disease analysis. Post-dissection, the prostate cells can be further cultured in vitro for mechanistic understanding. Since mouse prostate primary cells tend to lose their normal characteristics when cultured in vitro, we outline here a method for isolating the cells and growing them as 3D spheroid cultures, which is effective for preserving the physiological characteristics of the cells. These 3D cultures can be used for analyzing cell morphology and behavior in near-physiological conditions, investigating altered levels and localizations of key proteins and pathways involved in the development and progression of a disease, and looking at responses to drug treatments.

Genetically engineered mice are useful models for investigating prostate cancer mechanisms. Here we present a protocol to identify and dissect prostate lobes from a mouse urogenital system, differentiate them based on histology, and isolate and culture the primary prostate cells in vitro as spheroids for downstream analyses.

זיהוי ואפיון היסטולוגית, דיסקציה של האונות הערמונית עכבר במודלים תרבות חוץ גופית ספרואיד תלת-ממד

Genetically engineered mouse models (GEMMs) serve as effective pre-clinical models for investigating most types of human cancers, including prostate ...

A Spheroid Killing Assay by CAR T Cells

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric antigen receptor (CAR) redirected T cells obtained the most spectacular results, in particular with pediatric B-acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). Classical validation methods of CAR T cells rely on the use of specificity and functionality assays of the CAR T cells against target cells in suspension and in xenograft models. Unfortunately, observations made in vitro are often decoupled from results obtained in vivo and a lot of effort and animals could be spared by adding another step: the use of 3D culture. The production of spheroids out of potential target cells that mimic the 3D structure of the tumor cells when they are engrafted into the animal model represents an ideal alternative. Here, we report an affordable, reliable and easy method to produce spheroids from a transduced colorectal cell line as a validation tool for adoptive cell therapy (exemplified here by CD19 CAR T cells). This method is coupled with an advanced live imaging system that can follow spheroid growth, effector cells cytotoxicity and tumor cell apoptosis.

This protocol is designed to assess immunotherapeutic redirected T-cell (CAR T-cell) cytotoxicity against 3D structured cancerous cells (spheroids) in real time.

וזמינותו הרג ספרואיד על-ידי תאי T המכונית

Immunotherapy has become a field of growing interest in the fight against cancer otherwise untreatable. Among all immunotherapeutic methods, chimeric ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture vessels versus in vivo in human patients. This is due to the bottleneck selection of clonal populations of melanoma cells that can robustly grow in vitro in the absence of physiological conditions. Further, responses to therapy in two-dimensional tissue cultures overall do not faithfully reflect responses to therapy in melanoma patients, with the majority of clinical trials failing to show the efficacy of therapeutic combinations shown to be effective in vitro. Although xenografting of melanoma cells into mice provides the physiological in vivo context absent from two-dimensional tissue culture assays, the melanoma cells used for engraftment have already undergone bottleneck selection for cells that could grow under two-dimensional conditions when the cell line was established. The irreversible alterations that occur as a consequence of the bottleneck include changes in growth and invasion properties, as well as the loss of specific subpopulations. Therefore, models that better recapitulate the human condition in vivo may better predict therapeutic strategies that effectively increase the overall survival of patients with metastatic melanoma. The patient-derived xenograft (PDX) technique involves the direct implantation of tumor cells from the human patient to a mouse recipient. In this manner, tumor cells are consistently grown under physiological stresses in vivo and never undergo the two-dimensional bottleneck, which preserves the molecular and biological properties present when the tumor was in the human patient. Notable, PDX models derived from organ sites of metastases (i.e., brain) display similar metastatic capacity, while PDX models derived from therapy naive patients and patients with acquired resistance to therapy (i.e., BRAF/MEK inhibitor therapy) display similar sensitivity to therapy.

Patient-derived xenograft (PDX) models more robustly recapitulate melanoma molecular and biological features and are more predictive of therapy response compared to traditional plastic tissue culture-based assays. Here we describe our standard operating protocol for the establishment of new PDX models and the characterization/experimentation of existing PDX models.

מלנומה מטופלת-נגזר מודל Xenograft

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

Assessing Cell Viability and Death in 3D Spheroid Cultures of Cancer Cells

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. The power of this preparation lies in its ability to mimic many aspects of the in vivo conditions of tumors while being fast, cheap, and versatile enough to allow relatively high-throughput screening. The spheroid culture conditions can recapitulate the physico-chemical gradients in a tumor, including the increasing extracellular acidity, increased lactate, and decreasing glucose and oxygen availability, from the spheroid periphery to its core. Also, the mechanical properties and cell-cell interactions of in vivo tumors are in part mimicked by this model. The specific properties and consequently the optimal growth conditions, of 3D spheroids, differ widely between different types of cancer cells. Furthermore, the assessment of cell viability and death in 3D spheroids requires methods that differ in part from those employed for 2D cultures. Here we describe several protocols for preparing 3D spheroids of cancer cells, and for using such cultures to assess cell viability and death in the context of evaluating the efficacy of anticancer drugs.

Here, we present several simple methods for evaluating viability and death in 3D cancer cell spheroids, which mimic the physico-chemical gradients of in vivo tumors much better than the 2D culture. The spheroid model, therefore, allows evaluation of the cancer drug efficacy with improved translation to in vivo conditions.

הערכת הכדאיות תא ומוות ב 3D בתרבויות ספרואיד של תאים סרטניים

Three-dimensional spheroids of cancer cells are important tools for both cancer drug screens and for gaining mechanistic insight into cancer cell biology. ...

A 3D Spheroid Model as a More Physiological System for Cancer-Associated Fibroblasts Differentiation and Invasion In Vitro Studies

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor stroma, host fibroblasts are stimulated by cancer cells to differentiate. Thus, they acquire a phenotype that contributes to the tumor microenvironment and supports tumor progression. By using the spheroid model, we have set up such a 3D in vitro model system, in which we analyzed the role of laminin-332 and its receptor integrin &#945;3&#946;1 in this differentiation process. This spheroid model system not only reproduces the tumor microenvironment conditions in a more accurate way, but also is a very versatile model since it allows different downstream studies, such as immunofluorescent staining of both intra- and extracellular markers, as well as deposited extracellular matrix proteins. Moreover, transcriptional analyses by qPCR, flow cytometry and cellular invasion can be studied with this model. Here, we describe a protocol of a spheroid model to assess the role of CAFs&#39; integrin &#945;3&#946;1 and its ectopically deposited ligand, laminin-332, in differentiation and in supporting the invasion of pancreatic cancer cells.

The goal of this protocol is to establish a 3D in vitro model to study the differentiation of cancer-associated fibroblasts (CAFs) in a tumor bulk-like environment, which can be addressed in different analysis systems, such as immunofluorescence, transcriptional analysis and life cell imaging.

3D מודל ספרואיד כמו מערכת פיזיולוגית יותר עבור סרטן הקשורים בידול פיברותקיעות והפלישה ללימודי חוץ גופית

Defining the ideal model for an in vitro study is essential, mainly if studying physiological processes such as differentiation of cells. In the tumor ...

Characterization of the Effects of Migrastatic Inhibitors on 3D Tumor Spheroid Invasion by High-resolution Confocal Microscopy

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and invasive potential of cancer cells, and consequently the metastatic spread of disease, are being discovered and considered as complementary treatments in highly invasive cancers such as gliomas. Thus, generating data enabling the detailed analyses of cells in a 3D environment following the addition of a drug is required. The methodology described here, combining spheroid invasion assays with high-resolution image capture and data analysis by confocal laser scanning microscopy (CLSM), enabled detailed characterization of the effects of the potential anti-migratory inhibitor MI-192 on glioma cells. Spheroids were generated from cell lines for invasion assays in low adherent 96-well plates and then prepared for CLSM analysis. The described workflow was preferred over other commonly used spheroid-generating techniques due to both ease and reproducibility. This, combined with the enhanced image resolution attained by confocal microscopy compared to conventional wide-field approaches, allowed the identification and analysis of distinct morphological changes in migratory cells in a 3D environment following treatment with the migrastatic drug MI-192.

The effects of migrastatic inhibitors on glioma cancer cell migration in three-dimensional (3D) invasion assays using a histone deacetylase (HDAC) inhibitor are characterized by high-resolution confocal microscopy.

אפיון ההשפעות של מעכבי Migrastatic על הפלישה 3D הגידול ספרואיד על ידי מיקרוסקופ Confocal וקד ברזולוציה גבוהה

Drug discovery and development in cancer research is increasingly being based on drug screens in a 3D format. Novel inhibitors targeting the migratory and ...

Isolation of Stem-like Cells from 3-Dimensional Spheroid Cultures

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident stem cells are relatively quiescent with niche restraints in adult tissues, they enter the cell cycle in anchor-free three-dimensional (3D) culture and undergo both symmetric and asymmetric cell division, giving rise to both stem and progenitor cells. The latter proliferate rapidly and are the major cell population at various stages of lineage commitment, forming heterogeneous spheroids. Using primary normal human prostate epithelial cells (HPrEC), a spheroid-based, label-retention assay was developed that permits the identification and functional isolation of the spheroid-initiating stem cells at a single cell resolution.
HPrEC or cell lines are two-dimensionally (2D) cultured with BrdU for 10 days to permit its incorporation into the DNA of all dividing cells, including self-renewing stem cells. Wash out commences upon transfer to the 3D culture for 5 days, during which stem cells self-renew through asymmetric division and initiate spheroid formation. While relatively quiescent daughter stem cells retain BrdU-labeled parental DNA, the daughter progenitors rapidly proliferate, losing the BrdU label. BrdU can be substituted with CFSE or Far Red pro-dyes, which permit live stem cell isolation by FACS. Stem cell characteristics are confirmed by in vitro spheroid formation, in vivo tissue regeneration assays, and by documenting their symmetric/asymmetric cell divisions. The isolated label-retaining stem cells can be rigorously interrogated by downstream molecular and biologic studies, including RNA-seq, ChIP-seq, single cell capture, metabolic activity, proteome profiling, immunocytochemistry, organoid formation, and in vivo tissue regeneration. Importantly, this marker-free functional stem cell isolation approach identifies stem-like cells from fresh cancer specimens and cancer cell lines from multiple organs, suggesting wide applicability. It can be used to identify cancer stem-like cell biomarkers, screen pharmaceuticals targeting cancer stem-like cells, and discover novel therapeutic targets in cancers.

Using human primary prostate epithelial cells, we report a novel biomarker-free method of functional characterization of stem-like cells by a spheroid-based label-retention assay. A step-by-step protocol is described for BrdU, CFSE, or Far Red 2D cell labeling; three-dimensional spheroid formation; label-retaining stem-like cell identification by immunocytochemistry; and isolation by FACS.

בידוד של תאים כמו גזע מתרבויות תלת ממדיות ספרואיד

Despite advances in adult stem cell research, identification and isolation of stem cells from tissue specimens remains a major challenge. While resident ...

A Novel Stromal Fibroblast-Modulated 3D Tumor Spheroid Model for Studying Tumor-Stroma Interaction and Drug Discovery

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro model in the study of cancer stem/initiating cells, preclinical cancer research, and drug screening. The 3D spheroid models are superior to conventional tumor cell culture and reproduce some important characters of real solid tumors. However, conventional 3D tumor spheroids are made up exclusively of tumor cells. They lack the participation of tumor stromal cells and have insufficient extracellular matrix (ECM) deposition, thus only partially mimicking the in vivo conditions of tumor tissues. We established a new multicellular 3D spheroid model composed of tumor cells and stromal fibroblasts that better mimics the in vivo heterogeneous tumor microenvironment and its native desmoplasia. The formation of spheroids is strictly regulated by the tumor stromal fibroblasts and is determined by the activity of certain crucial intracellular signaling pathways (e.g., Notch signaling) in stromal fibroblasts. In this article, we present the techniques for coculture of tumor cells-stromal fibroblasts, time-lapse imaging to visualize cell-cell interactions, and confocal microscopy to display the 3D architectural features of the spheroids. We also show two examples of the practical application of this 3D spheroid model. This novel multicellular 3D spheroid model offers a useful platform for studying tumor-stroma interaction, elucidating how stromal fibroblasts regulate cancer stem/initiating cells, which determine tumor progression and aggressiveness, and exploring involvement of stromal reaction in cancer drug sensitivity and resistance. This platform can also be a pertinent in vitro model for drug discovery.

A novel three-dimensional spheroid model based on the heterotypic interaction of tumor cells and stromal fibroblasts is established. Here, we present coculture of tumor cells and stromal fibroblasts, time-lapse imaging, and confocal microscopy to visualize the formation of spheroids. This three-dimensional model offers a pertinent platform to study tumor-stroma interactions and test cancer therapeutics.

סטרומה הרומן פיברוהפיצוץ-מודנן 3D הגידול מודל ספרואיד ללמוד אינטראקציה סרטניים-סטרומה וגילוי הסמים

Tumor-stroma interactions play an important role in cancer progression. Three-dimensional (3D) tumor spheroid models are the most widely used in vitro ...

A 3D Spheroid Model for Glioblastoma

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were developed. These models may be particularly important in the field of neuro-oncology. Indeed, brain tumors have the tendency to invade the healthy brain environment. We describe herein an ideal 3D glioblastoma spheroid-based assay that we developed to study tumor invasion. We provide all technical details and analytical tools to successfully perform this assay.

Here, we describe an easy-to-use invasion assay for glioblastoma. This assay is suitable for glioblastoma stem-like cells. A Fiji macro for easy quantification of invasion, migration, and proliferation is also described.

מודל ספרואיד תלת-ממדי לגלינובלסטומה

Two-dimensional (2D) cell cultures do not mimic in vivo tumor growth satisfactorily. Therefore, three-dimensional (3D) culture spheroid models were ...