פרוטוקול זה מספק מתודולוגיה מתוקנת להכנת וטיפול ברקמת השריר בהגדרות פרה-קליניות ובניסויים קליניים, החשובה להשגת תוצאות אמינות בתחום ה-DMD. הטכניקות רלוונטיות עבור exon דילוג על נסיונות עבור DMD. והיתרון העיקרי הוא כי, הם מבוססים היטב לשחזור אם מתבצע באופן קולקטיבי.
טכניקות אלה מתמקדות בעיקר דילוג exon ב DMD, אבל עם שינוי של פריימרים, אותן טכניקות ניתן ליישם על מחלות אחרות שטופלו עם טיפולים splicing. שיטות אלה ניתן להשתמש כדי להשיג אקסון דילוג יעילות הן RNA וחלבון. כדי להכין מדגם לניתוח, ראשית לערבב כמויות שוות של מסטיק tragacanth ומים עד החניכיים הופך רך ודביק.
טוענים תערובת זו לתוך 25 מזרקים מיליליטר ולוותר 0.5 עד סנטימטר אחד של מסטיק על דיסקי פקק בודדים. סמן את הדיסקים בצד הנגדי והצב מיכל איזופנטאן בחנקן נוזלי עד שחלק מהנוזל קופא. מניחים כל דגימה לתוך מסטיק tragacanth על הדיסקים עם ציר אורך של כל שריר בניצב לפקק.
מניחים מסטיק סביב לתחתית של כל שריר כדי לעזור להחזיק את השריר במקום, ולהשתמש פינצטה להקפיא את הדגימות isopentane קר. מזיזים את הדגימות ברציפות למשך דקה אחת או עד להקפאה מוחלטת לפני הנחתן באופן זמני על קרח יבש. לאחר מכן, מניחים את הדגימות בבקבוקוני זכוכית לאחסון של 80 מעלות צלזיוס.
כדי לקטע את רקמת השריר הקפואה לניתוח, הגדר קריוסטט לטמפרטורת עבודה של 25 מעלות צלזיוס, ולהעלות את בלוק השריר על המחזיק. לקצץ את בלוק הרקמה עד חלקים שטוחים מושגים. לקבלת PCR תעתיק הפוך וניתוח כתם מערבי, לקבל 10 פרוסות מיקרומטר עבה.
לניתוח אימונוהיסטוכימי, השג שש עד שמונה פרוסות בעובי מיקרומטר, ולכתמת המטוקסילין ואאוסין, השג פרוסות בעובי 10 עד 12 מיקרומטר. לאחר הרכישה שלהם, למקם את החלקים פרוסים בשני צינורות מיליליטר. אחסן את הדגימות עבור PCR ורוקט מערבי ב 80 מעלות צלזיוס.
כאן, מערכת אלקטרופורזה שבב, תמונות ג'ל של תגובות PCR תעתיק הפוך, ואת תוצאות רצף של הלהקה דילוג משני חולים לפני ואחרי הטיפול עם oligonucleotide antisense בניסוי שלב הסלמה מנה אחת מוצגים. שני המטופלים מטפחים מחיקות. כצפוי, לפני הטיפול, שני המטופלים לא הראו דילוג ורק להקה שלא דילגה יכולה להיות חזותית.
לאחר 12 שבועות של טיפול, רצועה תחתונה ברורה דילגה היה חזותי עבור המטופל השני, עם זאת, זה עדיין היה קשה לזהות כל מוצר דילוג עבור המטופל הראשון. תוצאות רצף הראו שרשור של exons 47 ו 54 עבור החולה השני, ו exons, 44 ו 54 עבור החולה הראשון. כדי לחשב את אחוז הדילוגים, הריכוז הטוחן של הרצועה שדילגת עליה חולק על-ידי הרצועות שהמערכת דילגה עליהן והתהפך.
כצפוי, לא זוהתה להקת דיסטרופין על ידי כתם מערבי לפני הטיפול. לאחר הטיפול זוהתה רצועה מהחולה השני עם משקל מולקולרי נמוך יותר בהשוואה לזה שנצפה בשליטה הבריאה. החולה הראשון, לעומת זאת, לא הראה רמות ניתנות לגילוי של דיסטרופין לאחר הטיפול.
זה קריטי כדי לטפל ברקמת השריר כראוי, ולה מניח כל דגימה על מסטיק tragacanth באופן עקבי. ניתן לנתח את מקטעי הרקמה במספר דרכים שונות, כולל PCR מלאכותי, PCR דיגיטלי, כתם מערבי, אימונוהיסטוכימיה, ועם סוגים שונים של omics. טכניקות אלה ניתן להאיץ, הפיתוח, exon נוסף דילוג תרופות מיקוד exons שונים, והוא יכול להיות מיושם על הפיתוח של ויראלי מבוסס ושוב בעריכה עבור DMD.
