ריצוף גנום שלם, כריית גנום ורישת מולקולרית מהווים את הבסיס למדריך ספקטרומטריית המסה שפרוטוקול כריית הגנום שאנו מתארים כאן. והם הגישה העכשווית ביותר בגילוי מוצרים טבעיים. כריית גנום ורישת מולקולרית תואמות באשכול, ביאורים מקודדים ברצף גנום שלם עם חתימות ארגון מחדש כימיות מתמציות גולמיות המספקות סיכויים עצומים לחשיפת טבור על ידי מולקולות פעילות.
באופן עקרוני, כריית גנום מטרות יחיד או קבוצה קטנה של מולקולות לכל ניסוי. ובכך וכתוצאה מכך קצב גילוי איטי. במובן זה, שימוש בכריית גנום יחד עם נטוורקינג מולקולרי מייצג התקדמות חשובה למחקר מוצרים טבעיים.
ספקטרומטריית מסה מדריך-גנום כרייה היא שיטה רב-תכליתית אשר יכול לבנות מידע של מספר כימוטיפים הכלולים בכמות גדולה של נתונים מתמצית גולמית בו זמנית. כיום זוהי מתודולוגיה לטווח גבוה המסוגלת לחקור את רצף החיידקים, הפטריות או הצמחים. כימוטיפ לגנוטיפ וגנוטיפ לביואינפורמטיקה של כימוטיפים מקשרים בין אשכולות ביוסינתטיים והם מוצרי מולקולות קטנות.
שמיעת הפרוטוקול הוכח לאפיון מעמקי מחזור טבור מוצרי פפטיד שנצפו בתמציות מטבוליות של מיני סטרפטומיצ'יס. אבל זה ישים רצף פטרייתי וצמחים ותמציות גם כן. חשוב מאוד לאצור יפה ערכת נתונים של הגנום וכיום רצפי טיוטה מקוטעים הופכים יותר ויותר על ידי נתוני רצף כמעט גמורים.
כמו כן, פותחו אסטרטגיות שונות כדי לגשת למוצרים טבעיים ביו-אקטיביים חדשים ובוודאי לשלב אותם עם גישת MS-Guide. אנו מובילים לשיפור בבידוד המוצרים הטבעיים ובהבהת המבנה. כמו כאן אנחנו מחברים גנוטיפ לגישת כימותרפיה, קשרים ביואינפורמטיקה בין אשכולות biosynthetic ויש מוצרים מולקולה קטנה הם קריטיים.
כדי להעריך את מגוון ומעמד של תרכובות לקודד לפי גנום. מה שאומר השכפול. מאוחר יותר, ניתן ליצור מראש קיבוץ באשכולות בהתבסס על קווי דמיון בין יון באמצעות GNPS.
הדגמת ההליך תהיה ד"ר רנטה סיגריס ופרופסור אנגוליני משתפי הפעולה שלי במחקר זה. כדי להשיג מידע סיליקו על מטבוליזם משני צבירי גנים ביאורים מן הגנום רצף שלם. שלח את קובץ הרצף, בנק הגנים E-M-B-L או פורמט מהיר יותר, לפלטפורמה נגד ריסוק.
אז כמו אשכולות הגנים של עניין מנתוני הפלט המבוססים על האשכול הידוע הדומה ביותר. בהתבסס על מידע רצף ה-DNA של BGC, תכנון פריימריז בין 20 ל 25 נוקלאוטידים מאגפים את אשכול הגנים עבור streptomyces ecoli. הקרנת ספריית כרומוזום מלאכותית.
לאחר קבלת האורגניזם ההטרולוגי רקומביננטי על פי כתב היד, לחסן אחד 100 של טרום תרבות זנים בתקשורת תסיסה מתאימה. כגון מדיה נוזלית של ISP2. מניחים את התרבות על אינקובטור ב 30 מעלות צלזיוס ו 220 סל"ד, במשך שבעה ימים.
לאחר החיסון, צנטריפוגה התרבויות ב 2200 פעמים G במשך 10 דקות. השלך את התאים והעבר את העל-טבעי למשפך הפרדה. מוסיפים אחד לנפח אחד של אתיל אצטט ומנערים.
המתינו דקה עד שלוש דקות עד שהשכבות האורגניות והמוזגות ייפרדו. ולאסוף את השכבה האורגנית בבקבוק ארלנפייר. כדי להשיג נתוני MS/MS.
תכנת שיטות HPLC וספקטרומטריית מסה מתאימות באמצעות תוכנת הבקרה. יצוין כי רשת MS/MS היא הרשת המולקולרית הניתנת לגילוי בתנאים הספקטרומטריים המסים הנתנים. המר ספקטרום מסה לפורמט mzXML באמצעות MS Convert מאשף פרוטיאה.
התאם את פרמטרי הקלט עבור ההמרה. העלה את קבצי LC-MS/MS המומרים למסד הנתונים של GNPS. שתי אפשרויות זמינות.
שימוש בפרוטוקול העברת קבצים או ישירות בדפדפן באמצעות הפלטפורמה המקוונת. לאחר יצירת חשבון ב- GNPS, היכנס לחשבון שנוצר ובחר צור רשת מולקולרית. הוסף תפקיד.
כדי לבצע אפשרויות בסיסיות. בחר את קבצי mzXML כדי לבצע את הרשת המולקולרית. ארגן אותם בקבוצות של עד שש קבוצות.
אז כמו הספריות לשגרת הדרפילציה. בחר את סובלנות מסה יון מבשר וקטע Da על סובלנות המונית של 0.02 דלתון ו 0.05 דלתון בהתאמה. כדי לבצע אפשרויות רשת מתקדמות, בחר את הפרמטרים שהשפיעו ישירות על הגודל והטופס של אשכול הרשת.
פרמטרים מתקדמים נמצאים בתיעוד GNPS. בחר כתובת דואר אלקטרוני כדי לקבל התראה בעת ביצוע העבודה ולשלוח את המשימה. כדי לנתח תוצאות GNPS.
היכנס ל- GNPS. בחר משימות, עבודה שפורסמה, בוצעה כדי לפתוח משימה. דף אינטרנט נפתח עם כל התוצאות המתקבלות מרשת מולקולרית המוצגת.
בחר הצג משפחות ספקטרליות בפריט חזותי של רשת דפדפן כדי לראות את כל אשכולות הרשת. רשימה מוצגת עם כל אשכולות הרשת המולקולרית שנוצרו. זיהוי מולקולרי לא סופי מוצג בכל תעודות הזהות.
בחר הצג כדי להציג אותם באופן חזותי. כדי לנתח את אשכול הרשת המולקולרית, בחר לדמיין את הרשת. בתיבה תוויות צומת, בחר מסת אב.
בתיבה תוויות קצה, בחר סימן שותף או דלתא Emz. כדי לבחון דמיון צומת או הבדל מסה בין צמתים בהתאמה. במקרה של ניתוח מרובה קבוצה, לחץ על צייר עוגות בתיבת צביעת הצומת.
כדי לבחון את התדירות שבה מופיע כל צומת בכל קבוצה. כדי לראות את כל הספריות, בחר תצוגה, את כל הספריה, כניסות. פתח את ספקטרום הפיצול ישירות בפלטפורמת GNPS.
או בקבצים גולמיים מקוריים כדי לאשר באופן ידני תרכובות dereplication והבהיר מבנה של תרכובות קשורות. הפרוטוקול הודגם בהצלחה באמצעות שילוב של כריית גנום, ביטוי הטרולוגי וגישות קוד מונחה MS. כדי לגשת חדש מיוחד Valinomycin ומולקולות אנלוגיות.
הגנום למולקולה זרימת עבודה עבור היעד valinomycin מוצג כאן. הכרומטוגרמה הראתה כי ולינומיצין, מונטנסטטין וחמישה אנלוגים יוצרו על ידי ולינומיצין, אשכולות גנים ביוסינתטיים ביטוי במארח הטרולוגי. ions רשת מולקולרית המתאימים valinomycin, תרכובת ידועה כבר עם אשכולות גנים biosynthetic המקביל ביאורים מינים סטרפטומיציס, CBM AI שתי אפס ארבע שתיים גנום.
מקובצים עם יונים הקשורים אנלוגים, מתואר לראשונה עבור אשכול גנים biosynthetic valinomycin. ספקטרום MS ומבנים כימיים עבור valinomycin ואנלוגיות הקשורות, מוצגים כאן. ביצוע ריצוף גנום שלם ואוצר ערכת נתונים נכונה הוא הצעד הראשון לבחירת אשכול biosynthetic עבור MS-מדריך כריית הגנום.
ההליך כולו יכול להתבצע עם סוגים פראיים מחרוזת תמצית גולמית, אבל אתה יכול לבחור את אשכול הגנים של העניין שלך ולקדם ביטוי הטרולוגי. שיטות שונות מתוארות כדי ללכוד את כל אשכול הגנים הביוסינתטיים מדגם DNA. היתרון החזק ביותר של פרוטוקול זה הוא יכולתו לשכפל במהירות פרופילים מטבוליים ולהתרבות מידע גנומי עם נתוני טרשת נפוצה.
על מנת להבהר אלה כגון של מולקולות חדשות. וכריית מדריך-גנום המוני תוארה לראשונה בתחום הגנומיקה הגפטידית וגליקונומיקה על ידי דוריס צ'ים ועמיתיה. ואחרי כניסתה של גישת הכרייה המשולבת של NPS וכריית הגנום הפכו לשדרה המגוונים ביותר לחיבור רשתות מולקולריות עם יכולות ביו-סינתטיות.
