Le séquençage du génome entier, l’extraction du génome et le réseautage moléculaire constituent la base du guide de spectrométrie de masse que nous décrivons ici. Et sont l’approche la plus contemporaine dans la découverte de produits naturels. L’extraction du génome et la mise en réseau moléculaire correspondent en grappe, dans des annotations codées dans le séquençage du génome entier avec des signatures de restructuration chimique à partir d’extraits bruts offrant des perspectives massives pour découvrir le nombril par des molécules actives.
En principe, l’extraction du génome cible un seul ou un petit groupe de molécules par expérience. Ce qui entraîne un taux de découverte lent. En ce sens, l’utilisation de l’extraction du génome ainsi que le réseautage moléculaire représentent une avancée importante pour la recherche sur les produits naturels.
L’exploration du génome du guide de spectrométrie de masse est une méthode polyvalente qui peut structurer simultanément l’information de plusieurs chimiotypes contenus dans la grande quantité de données provenant d’un extrait brut. Aujourd’hui, il est haute gamme méthodologie capable d’explorer les bactéries, fongiques ou plantes séquence fournissant. Le chimiotype au génotype et au génotype à la bioinformatique de chimiotype relie les grappes biosynthétiques et sont de petits produits de molécules.
L’audition du protocole est démontrée pour caractériser les profondeurs du cycle du nombril Peptide produits observés dans les extraits métaboliques des espèces de streptocyces. Mais il s’applique à la séquence fongique et végétale et des extraits ainsi. Il est très important d’avoir un ensemble de données sur le génome bien organisé et, de nos jours, des séquences de brouillons fragmentées sont de plus en plus supplantées par des données de séquence presque terminées.
En outre, différentes stratégies ont été élaborées pour accéder à de nouveaux produits naturels bioactifs et certainement les combiner avec l’approche MS-Guide. Nous allons conduire à l’amélioration de l’isolement des produits naturels et l’élucidation de la structure. Comme ici nous connectons le génotype à l’approche de chimiotype, les liens bioinformatiques entre les grappes biosynthétiques et il y a de petits produits de molécule sont cruciaux.
d’estimer la variété et la classe des composés et d’encoder par génome. Ce qui veut dire la réplication. Plus tard, le clustering basé sur des similitudes d’ion peut être préformé en utilisant GNPS.
Le Dr Renata Sigrist et le professeur Angolini, mes collaborateurs dans cette étude, démontreront la procédure. Pour obtenir en silico des informations sur le métabolisme secondaire des annotations de faisceaux génétiques à partir d’un génome de séquence complète. Soumettez le fichier séquence, banque de gènes E-M-B-L ou format plus rapide, à une plate-forme anti-smash.
Donc, comme les grappes génétiques d’intérêt à partir des données de sortie basées sur le cluster le plus similaire connu. Sur la base des informations de séquence d’ADN du BGC, concevoir des primaires entre 20 et 25 nucléotides flanquant le groupe génétique pour les streptomyces ecoli. Criblage artificiel de bibliothèque de chromosome.
Après avoir obtenu l’organisme héterologique recombinant selon le manuscrit, inoculer un 100e des souches préculture dans les supports de fermentation appropriés. Tels que les supports isp2 liquides. Placez la culture sur un incubateur à 30 degrés Celsius et 220 RPM, pendant sept jours.
Après l’inoculation, centrifuger les cultures à 2200 fois G pendant 10 minutes. Jeter les cellules et transférer le supernatant dans un entonnoir séparateur. Ajouter un à un volume d’acétate d’éthyle et agiter.
Attendez une à trois minutes pour que les couches organiques et acquiescées se séparent. Et recueillir la couche organique dans un flacon Erlenmeyer. Pour acquérir des données ms/MS.
Programme approprié HPLC et les méthodes de spectrométrie de masse en utilisant le logiciel de contrôle. Il est à noter que le réseau MS/MS est le réseau moléculaire détectable dans les conditions spectrométriques de masse données. Convertissez les spectres de masse en format mzXML à l’aide de MS Convert de l’assistant protéa.
Ajustez les paramètres d’entrée pour la conversion. Téléchargez les fichiers LC-MS/MS convertis dans la base de données GNPS. Deux options sont disponibles.
Utilisation d’un protocole de transfert de fichiers ou directement dans un navigateur via la plate-forme en ligne. Après avoir créé un compte dans GNPS, connectez-vous au compte créé et sélectionnez créer un réseau moléculaire. Ajouter un titre d’emploi.
Pour effectuer des options de base. Sélectionnez les fichiers mzXML pour effectuer le réseau moléculaire. Organisez-les en six groupes.
Donc, comme les bibliothèques pour la routine de déreplication. Sélectionnez la tolérance à la masse des ion précurseurs et fragmenter Da sur la tolérance de masse de 0,02 Dalton et 0,05 Dalton respectivement. Pour effectuer des options réseau avancées, sélectionnez les paramètres qui ont directement influencé la taille et la forme du cluster réseau.
Les paramètres avancés sont dans la documentation GNPS. Choisissez une adresse e-mail pour recevoir une alerte lorsque le travail est terminé et soumettre le travail. Analyser les résultats du GNPS.
Connectez-vous au GNPS. Sélectionnez des emplois, travail publié, fait pour ouvrir un travail. Une page Web s’ouvre avec tous les résultats obtenus à partir de la mise en réseau moléculaire affichée.
Sélectionnez afficher les familles spectrales dans le visualiseur réseau du navigateur pour voir tous les clusters réseau. Une liste est affichée avec tous les clusters de réseautage moléculaire générés. L’identification moléculaire provisoire est affichée dans toutes les pièces d’identité.
Sélectionnez le spectacle pour les visualiser. Pour analyser le cluster réseau moléculaire, sélectionnez visualiser le réseau. Dans la boîte d’étiquettes des nœuds, sélectionnez la masse des parents.
Dans la boîte d’étiquettes de bord, sélectionnez co-sign ou Delta Emz. Observer la similitude des nœuds ou la différence de masse entre les nœuds respectivement. Dans le cas de l’analyse multi-groupes, cliquez sur dessiner des tartes dans la boîte à colorier nœud.
Observer la fréquence à laquelle chaque nœud apparaît dans chaque groupe. Pour voir toutes les bibliothèques, sélectionnez la vue, toutes les bibliothèques, les visites. Ouvrez les spectres de fragmentation directement dans la plate-forme GNPS.
Ou dans les fichiers bruts originaux pour confirmer manuellement les composés de dréplication et l’élucidation de la structure des composés connexes. Le protocole a été illustré avec succès à l’aide d’une combinaison d’exploration du génome, d’expression héterologeuse et d’approches de code guidées par la SP. Pour accéder à de nouvelles molécules spécialisées de valinomycine et analogiques.
Le flux de travail génome à molécule de la valinomycine cible est présenté ici. Le chromatogramme a prouvé que la valinomycine, la montanastatine et cinq analogues ont été produits par valinomycine, expression biosynthétique de faisceaux de gène dans un hôte heterologous. Ions de réseautage moléculaire correspondant à la valinomycine, un composé déjà connu avec les grappes génétiques biosynthétiques correspondantes annotées chez les espèces de streptomyces, CBM AI deux zéro quatre deux génomes.
Sont regroupés avec des ions liés aux analogues, d’abord décrit pour le cluster génétique biosynthétique de valinomycine. Les spectres de SP et les structures chimiques pour la valinomycine et les analogues connexes, sont montrés ici. Effectuer le séquençage du génome entier et un véritable ensemble de données de séchage est la première étape pour l’élection d’un cluster biosynthétique pour MS-guider l’exploration du génome.
L’ensemble de la procédure peut être effectuée avec les types sauvages string extrait brut, mais vous pouvez choisir de sélectionner le groupe génétique de votre intérêt et de promouvoir l’expression héterologique. Différentes méthodes sont décrites pour capturer l’ensemble du groupe génétique biosynthétique à partir d’un échantillon d’ADN. L’avantage le plus important de ce protocole est sa capacité de reproduire rapidement les profils métaboliques et de reproduire des informations génomiques avec des données sur la SP.
Afin d’élucider ces molécules telles que de nouvelles molécules. Et l’extraction du génome du guide de masse a d’abord été décrite dans le domaine de la génomique peptidique et de la glycogéomique par Doris Chime et ses collègues. Et après l’introduction de la métabolomique intégrée NPS et l’approche d’extraction du génome sont devenus la voie la plus polyvalente pour connecter les réseaux moléculaires avec les capacités biosynthétiques.
