פרוטוקול זה מאפשר נגזרת של נוירונים אוהדים מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. תאים אלה יאפשרו למדען לחקור הפרעות אנושיות המשפיעות על מערכת העצבים הסימפתטית. טכניקה זו מאפשרת נגזרת של נוירונים אוהדים בתנאי פגישה מחולקים ללא מאכילים ביעילות מדרגית גבוהה.
התוצאה היא נוירונים פעילים חשמלית ב 20 ימים. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מחלות הנגרמות על ידי מערכת העצבים הסימפתטית מתפקדת, זה יכול לשמש גם עבור מידול מחלות, רפואה רגנרטיבית, הקרנת סמים. תאים אלה יכולים לשמש במבחנה כדי לחדש כל רקמה בתוך מערכת תרבת שותף, למשל, לחקר ויסות רקמת לב.
כאשר תרבות תאי הגזע הפלוריפוטנטיים האנושיים מגיעה ל-80 עד 90%, יש לצפות במושבות גדולות עם קצוות בהירים וחלקים. לפיצול, לשטוף את התרבות עם PBS לפני הטיפול בתאים עם ארבעה מיליליטר של 0.25 EDTA טוחן ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני. לאחר שתי דקות, לשטוף את הצלחת עם 10 מיליליטר של E8 בינוני ולהעביר את ההשעיה תא מנותק צינור חרוט 15 מיליליטר.
ואז להעביר 500 microliters של תאים לתוך aliquot 9.5 מיליליטר של מדיום E8 טרי. וצלחת תאי הגזע על ויטרונצין חדש מצופה 100 מילימטר מנות. יום אחד לפני אינדוקציה בידול, מצפה את המספר המתאים של שש צלחות גם עם שני מיליליטר של מטריצת קרום מרתף לכל באר.
ולאחסן את הצלחות בארבע מעלות צלזיוס לילה. למחרת בבוקר, לחמם את הצלחות לטמפרטורת החדר ולשטוף את מוכן לפצל תרבות תאי גזע פלוריפוטנטי אנושי פעמיים עם PBS טרי לכל לשטוף. לאחר הכביסה השנייה, לטפל בתאים עם שבעה מיליליטר של 0.5 מילימולאר EDTA במשך 15 דקות באינקובטור תרבות התא לפני שאפת תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים צפים והעברת התאים שנקטפו לתוך צינור 50 מיליליטר.
הוסף נפח שווה של PBS לצינור כדי לדלל את EDTA ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. תן את גלולה במיליליטר אחד של יום 01 התברות בינוני לפני הוספת נפח מתאים של מדיום לחשבונאות. לדלל את התאים ל 1.25 פעמים 10 לתאים החמישיים לכל ריכוז סנטימטר מרובע למיליליטרים של מדיום התברואה ל באר.
שאף את כל פתרון מטריצת קרום המרתף מכל באר של צלחת מוכנה בעבר לשש היטב. ואז לזרוע שני מיליליטר של תאים לתוך כל באר ולה מניחים את הצלחת באינקובטור תרבות התא. למחרת בבוקר, להאכיל את התאים עם שלושה מיליליטר של יום 01 מדיום התברואה ל הבאר.
ביום השני של ההידול, להאכיל את התאים עם שלושה מיליליטר של היום 2 עד 10 מדיום ההתברות לגם, ולאחר מכן להאכיל את התאים כל יומיים עד יום 10. כדי לצבור את תאי הסמל העצבי לתוך כדורידים, ביום 10, לשטוף את התאים עם PBS. ולהוסיף שני מיליליטר של מדיום דיסוציאציה לכל באר.
לאחר 20 דקות באינקובטור תרבות התא, להעביר את התאים הצפים לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר ולהביא את נפח ההשעיה בצינור ל 50 מיליליטר עם PBS טרי. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. ולתלות מחדש את גלולה בנפח מספיק של יום 10 עד 14 מדיום כדורי לספירה.
לאחר הספירה, לדלל את התאים לחמש פעמים 10 לתאים החמישיים לכל 500 מיקרוליטר ריכוז באמצעות יום 10 עד 14 מדיום כדורי. וצלחת 500 microliters של תאים לתוך כל באר של קובץ מצורף נמוך במיוחד צלחת 24-well. ואז להחזיר את התאים לאנקובטור תרבות התא.
כדי לגרום לתרבות כדורית מינימלית, ביום 11 של תרבות, להאכיל את spheroids סמל עצבי עם 500 microliters נוספים של היום 10 עד 14 מדיום כדורית לגם. ביום 12, להטות את הצלחת כדי לצבור את כדורי בצד אחד של הצלחת. ובזהירות שאף בינוני ככל האפשר מכל גם בלי שאגם ספירואידים.
ואז להאכיל את הכדורואידים עם מיליליטר אחד של היום 10 עד 14 מדיום כדורי לגם. כדי לגרום לתרבות כדורית מורחבת, ביום 15, להאכיל את הכדורואידים עם 1.5 מיליליטר של היום 10 עד 14 בינוני כדורית בתוספת 0.5 חומצה רטינואית מיקרומולרית לגם. ואז להחזיר את הכדורים לאינקובטור תרבות התא.
עבור התבינות נוירון אוהד, ביום 14 או 28, להטות את הצלחת כדי לצבור את הכדורים בצד אחד של הצלחת בזהירות שאפה בינונית ככל האפשר. להאכיל את התאים עם מיליליטר אחד של מדיום נוירון סימפטי. כדי לפרק אגרגטים כדוריים גדולים לספרואידים קטנים יותר, להוסיף לא יותר ממיליליטר אחד של מדיום ל הבאר ואת פיפטה כדורידים חמש עד 10 פעמים לפני הפיצול.
ולהסיר את פיברונטין למינין עודף מן מוכן בעבר 24 צלחות היטב. לפצל את הצלחת מיליליטר אחד של כדוריות מכל באר על צלחת התרבות ספרואיד 24 בארות בין ארבע בארות נפרדות של צלחת חדשה מצופה 24 בארות. הוסף 250 microliters של מדיום נוירון סימפטי טרי לכל באר.
ות למקם את הצלחת באינקובטור תרבות התאים. למחרת בבוקר, להחליף את המדיום בכל באר עם מיליליטר אחד של מדיום נוירון סימפטי בתוספת 0.125 חומצה רטינואית micromolar ולהחזיר את הצלחת לאנקובטור תרבות התא. לאחר יום 35, להאכיל את הנוירונים על ידי החלפת בזהירות רק מחצית המדיום הקיים בכל באר עם מדיום טרי.
לפני ההידול, מושבות תאי הגזע הפלוריפוטנטיות האנושיות צריכות להיות עגולות עם קצוות מבריקים וחלקים ומעט מאוד התבוללים. התאים מבטאים את סמן הסמל העצבי Sox10 מיום 4 עד 10. תאי סמל עצבי מגיחים ברכסים חשוכים צפופים הנראים מהיום השישי.
רכסים אלה גם מבטאים את Sox10. בשלב תאי פסגת העצב, Sox10 בקורלציה עם סמן פני התא CD49D, אשר ניתן להשתמש בהם כדי למיין את תאי הסמל העצבי. אוכלוסיות ממוינות ולא ממוינות חיוביות ייצרו כדוריות סמל עצבי באופן דומה.
בעוד תאים ממוינים שליליים אינם מצטברים כראוי, אינם מייצרים כדוריות עגולות, חלקות ובריאות למראה ומתות תוך שלושה עד ארבעה ימים. יתר על כן, כאשר spheroids סמל עצבי מושווים ביום 14, תעתיק הפוך כמותי PCR עבור ציצית עצבית סמני עצבים סימפטיים, הבדלים משמעותיים בין התאים ממוינים ולא ממוינים לא ניתן לזהות. ביום 20 או 35, פרוטוקולים מינימליים או מורחבים בהתאמה, נוירואידים ניתן לראות גדל בתבנית רדיאלי מן הספרואידים המצורפת.
סמנים הקשורים סינתזה נוראדרנלין ותחבורה באים לידי ביטוי בשלב זה, כמו גם Hox6 דרך תשעה גנים ציצים עצביים גזע. הקלטה אלקטרופיזיולוגית מזהה גם פעילות עצבית מהיום ה-20. פעילות כזו יכולה להיות משופרת או מדוכאת על ידי תרופות המכוונות autoreceptors של נוירונים אוהדים להתאים את הפונקציונליות של נוירונים מובחנים.
התומכים האנושיים עצמם חייבים להיות בריאים החל מהיום אפס של ההתבראות, אחרת, הניסוי צפוי להיכשל. מעכבים פרמקולוגיים או מפעילים ניתן להוסיף את הנוירונים כדי להבין את ההתנהגות הרגילה או הפתולוגית שלהם. שיטה זו פותחת שדרה חדשה לחקר ביולוגיה ופתולוגיה סימפטית, שכן כיום ניתן להשיג ביופסיות של נוירונים סימפטיים מבני אדם בקלות.
