The authors thank Mike Myles, Sam Saunders, and C.W. Elton at the ECU Multimedia &amp; Technology Services for providing assistance in video production. We acknowledge the grant support from North Carolina Biotechnology Center, Golfers against Cancer, Brody Brothers Endowment Fund, American Heart Association, and ECU/Vidant Cancer Research and Education Fund (L.V.Y. and M.J.R.).

1. Assay סגירת פצע תרבית תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוק תאים מצלחת תרבית הרקמה באמצעות 0.25% פתרון טריפסין-EDTA. גלולה תאים בצינור חרוטי 15 מיליליטר על ידי צנטריפוגה, לשאוב supernatant, מחדש תאים להשעות תקשורת והתרבות. פלייט המספר המתאים של תאים בצלחת 6 היטב למפגש 100% ב24 שעות. הערה: ייתכן שתהיינה צורך בדיקות כדי לקבוע את הזמן ואת מספר התאים כדי להשיג מפגש 100% בשל סוג התא ואת גודל בשימוש גם (לדוגמא, 1 x 10 6 B16F10 תאים מלנומה הם זורעים בטוב של צלחת 6 היטב 24 שעות לפני דור הפצע). לחלופין, ניתן להשתמש ב12 גם צלחות או 24 גם. הערה: אם זמין, יכולים להיות שנזרעו תאים לתוך תרבות-Insert (מLLC ibidi) על צלחת רקמת תרבות מטופלים עושה את הפצע מראש להק. תרבות-Insert יכול להגן על פני השטח של צלחת תרבית רקמה מנזק על ידי קצה פיפטה. אם תרבות-Insert משמש צעד השמט1.2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבת סטרילית (בדרך כלל מכסה המנוע בטיחות ביולוגי) להשתמש קצה פיפטה 200 μl ללחוץ בחוזקה נגד העליון של הצלחת בתרבית רקמה ובמהירות להפוך את פצע אנכי למטה דרך monolayer התא. קצה פיפטה בגדלים שונה ניתן להשתמש כדי להפוך את גודל הפצע שהוא רצוי. אל תשתמש בכוח מופרז נגד צלחת תרבית הרקמה עם קצה פיפטה כפי שהוא עלול לגרום נזק לפני השטח. אם הפצע הוא להק מראש, ניתן להשמיט את הצעד הזה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לשאוב תקשורת ופסולת תא. לאט לאט להוסיף מספיק תקשורת ותרבות על הקיר גם כדי לכסות את תחתית היטב ולהימנע מניתוק תאים נוספים. בעקבות הדור והבדיקה של הפצע צריכה לקחת תמונה ראשונית. מניחים את צלחת תרבית רקמה בחממה שנקבעה בטמפרטורה המתאימה וCO הריכוז 2 (בדרך כלל 37 ° C ו 5% CO 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במספר נקודות זמן, למשל כל 3 שעות, להסיר את הצלחת מincubatאו ולמקם אותו תחת מיקרוסקופ הפוכה כדי לצלם תמונה תמונת מצב ולבדוק לסגירת פצעים. אם מיקרוסקופיה הזמן לשגות זמינה, לקחת תמונה כל מספר X של דקות (בדרך כלל מתחיל עם כל 5 דקות) לכל משך זמן בטמפרטורה ו2 תא מבוקר CO. בהתאם לסוג התא, זמן סגירת פצע עשוי להשתנות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את התוצאות של תמונות תמונה, למדוד את המרחק בצד אחד של הפצע האחר באמצעות סרגל קנה מידה. לנתח וסגירת פצע באופן ברור בהווה לאורך זמן באמצעות עלילת פיזור או גרף עמודות, למשל איור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לנתח את תמונות הזמן לשגות, לייבא את התמונות לתוך תוכנת ImageJ (זמינה באופן חופשי בhttp://rsb.info.nih.gov/ij/) לעשות וידאו. כדי לעשות ImageJ הפתוח, לחץ על קובץ, יבוא, ותמונה ברצף. מצא את הקובץ עם תמונות; לחץ על התמונה הראשונה בקובץ. לשמור וידאו על ידי בחירת קובץ, שמירה בשם וAVI. תאים נודדים בודדים אפשר לראות לCharacterize תנועה כיוונית. יתר על כן, מאפיינים מורפולוגיים כגון היווצרות lamellipodia והכחשת קצה נגררת ניתן ללמוד גם כן (איור 2 ווידאו נוסף). </li></ol> 2. נדידת תאי Transwell ופלישת Assay <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבת סטרילית (בדרך כלל מכסה המנוע בטיחות ביולוגי) לנתק את התאים מן צלחת תרבית רקמה באמצעות חיץ אינו אנזימטית התנערות תא או 0.25% פתרון טריפסין-EDTA, תאי גלולה ידי צנטריפוגה, ולשאוב את התקשורת הקיימת עוזבת את תאי pelleted. Re-להשעות תאים בתרבית תאי תקשורת חופשית בסרום המכילה BSA 0.1% (אלבומין בסרום שור). הערה: בהתאם לשורת התאים נחקר 0.25% טריפסין-EDTA עלול להשפיע על נדידת תאים ופלישה בשל המחשוף של קולטנים שונים על פני תא 17. שים לב: מספר התאים למ&quot;ל תלוי בגודל של התאים. ייתכן שתהיינה צורך בבדיקות נוספות כדי למצוא את צפיפות זריעה שהפרהVides את התוצאות הטובות ביותר. בדרך כלל 1 x 10 6 תאים / מיליליטר הוא נקודת התחלה טובה עבור רוב סוגי תאים בעת השימוש ב24 גם transwell להוסיף. יש מגוון של גדלי transwell הכנס ואת מספר התאים הוסיפו צריכה להיות מותאם לבהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> של פתרון תא פלייט 100 μl על גבי קרום המסנן בכנס transwell והדגירה של 10 דקות 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 כדי לאפשר לתאים להתיישב. הערה: הגודל הנקבובית המסוים של קרום transwell משמש תלוי בגודל הבודד של התאים במדגם. לדוגמא, אם התאים הם קטנים מדי שהם יכולים לעבור דרך הנקבוביות ללא הצורך כדי להקל על הגירה או אם הם גדולים מדי הם עשויים שלא להתאים דרך הנקבוביות. ישנם כמה מוסיף transwell עם גודל נקבובית שנעים בין 3 מיקרומטר, 5 מיקרומטר, ו8 מיקרומטר עבור מבחני נדידת תאים. מוסיף transwell זמינים מסחרי מחברות כמו קורנינג. שים לב: מ &#39;transwellassay igration ניתן לשנות בקלות לבצע את assay פלישת תא. כדי לעשות זאת, להוסיף חומרים (ECM) מטריצה ​​תאית על גבי קרום transwell ולאחר מכן להוסיף את התאים על גבי ECM. לדוגמא, Matrigel מופשר ומעובה על קרח, ולאחר מכן 30-50 μl של Matrigel מתווסף 24 גם transwell להוסיף והתגבש בחממה 37 מעלות צלזיוס למשך 15-30 דקות כדי ליצור שכבת ג&#39;ל דקה. פתרון תא מתווסף על גבי ציפוי Matrigel כדי לדמות פלישה באמצעות מטריקס. שים לב: יש הבדלים ברורים בין נדידת תאי transwell ומבחני פלישת תא transwell. Assay נדידת תאי transwell מודד את יכולת chemotactic של תאים כלפי הכימותרפיה attractant. Assay פלישת תא transwell, לעומת זאת, מודד שני chemotaxis תא ואת הפלישה של תאים באמצעות מטריצה ​​תאית, תהליך שהוא נמצא בדרך כלל בהתפשטות גרורה סרטנית או התפתחות עוברית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה, מאוד carefully להוסיף 600 μl של הכימותרפיה attractant הרצויה לתוך החלק התחתון של התא התחתון בצלחת 24 גם. הוסף את הכימותרפיה attractant מבלי להזיז את הכנס transwell ולמנוע יצירת בועות. ודא את נוזל הכימותרפיה attractant בבאר התחתונה במגע עם הקרום בבאר העליונה כדי ליצור שיפוע chemotactic. זמן דגירה תלוי בסוג התא והכימותרפיה attractant בשימוש. הערה: ייתכן שתהיינה צורך בדיקות נוספות על מנת לקבוע את תקופת הדגירה. הערה: תאים חסיד, התאים נדדו יצרפו לצד השני של הקרום 1,8 האחר. כימות של תאים נדדו יכולה להתבצע בעקבות צעדי 2.4-2.8 (שלבים 2.4-2.8 לא צריכה להתבצע בסביבת סטרילית). לתאים שאינם חסיד, התאים נדדו יירד לתקשורת בתא התחתון. מספר התאים נדדו ניתן לספור באמצעות hemocytometer או זרימת cytometer 5. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את תוסף transwell מהצלחת. השתמש המוליך כותנה שקצה כמספר פעמים הדרוש כדי להסיר בזהירות את התקשורת ותאים הנותרים שלא היגר מהחלק העליון של הקרום ללא פגיעה בו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 600-1,000 μl של 70% אתנול לתוך באר של צלחת 24 גם. במקום להכניס transwell לתוך אתנול 70% ל10 דקות כדי לאפשר קיבוע תא. הסר transwell להכניס מצלחת 24 היטב ולהשתמש במוליך כותנה שקצה כדי להסיר אתנול שנותר מהחלק העליון של הקרום. לאפשר קרום transwell לייבוש (בדרך כלל 10-15 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 600-1,000 μl של .0.2% סגולים גביש לתוך באר של צלחת 24 גם ולמקם את הקרום לתוכו מכתימה. דגירה בטמפרטורת חדר למשך 5-10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר בעדינות סגולה גביש מהחלק העליון של הקרום עם קצה פיפטה או המוליך כותנה שקצהו. בזהירות רבה, כדי למנוע כביסה את התאים קבועים, טובל את הקרום למים מזוקקים כמספר פעמים הדרוש כדי להסיר את גלאים גביש העודפיםלא. לאפשר קרום transwell לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צפו מתחת מיקרוסקופ הפוכה ולספור את מספר התאים בשדות מבט שונים כדי לקבל סכום ממוצע של תאים שהגרו דרך הממברנה לכיוון הכימותרפיה attractant ומחוברים בחלקו התחתון של הקרום (איור 3). </li></ol>

<ol>
	<li>Castellone, R. D., Leffler, N. R., Dong, L., Yang, L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+tumor+cell+migration+and+metastasis+by+the+proton-sensing+GPR4+receptor.">Inhibition of tumor cell migration and metastasis by the proton-sensing GPR4 receptor.</a> Cancer Lett. 312 (2), 197-208 (2011).</li><li>Hall, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoskeleton+and+cancer.">The cytoskeleton and cancer.</a> Cancer Metastasis Rev. 28, (2009).</li><li>Lauffenburger, D. A., Horwitz, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration:+a+physically+integrated+molecular+process.">Cell migration: a physically integrated molecular process.</a> Cell. 84 (3), 359-369 (1996).</li><li>Peter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Migration+to+apoptotic+&amp;#34;find-me&amp;#34;+signals+is+mediated+via+the+phagocyte+receptor+G2A.">Migration to apoptotic &amp;#34;find-me&amp;#34; signals is mediated via the phagocyte receptor G2A.</a> J. Biol. Chem. 283 (9), 5296-5305 (2008).</li><li>Radu, C. G., Yang, L. V., Riedinger, M., Au, M., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T+cell+chemotaxis+to+lysophosphatidylcholine+through+the+G2A+receptor.">T cell chemotaxis to lysophosphatidylcholine through the G2A receptor.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101 (1), 245-250 (2004).</li><li>Buul, J. D., Hordijk, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signaling+in+leukocyte+transendothelial+migration.">Signaling in leukocyte transendothelial migration.</a> Arterioscler Thromb. Vasc. Biol. (5), 824-833 (2004).</li><li>Yang, L. V., Heng, H. H., Wan, J., Southwood, C. M., Gow, A., Li, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+promoters+and+polyadenylation+regulate+tissue-specific+expression+of+Hemogen+isoforms+during+hematopoiesis+and+spermatogenesis.">Alternative promoters and polyadenylation regulate tissue-specific expression of Hemogen isoforms during hematopoiesis and spermatogenesis.</a> 228 (4), 606-616 (2003).</li><li>Yang, L. V., Radu, C. G., Wang, L., Riedinger, M., Witte, O. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gi-independent+macrophage+chemotaxis+to+lysophosphatidylcholine+via+the+immunoregulatory+GPCR+G2A.">Gi-independent macrophage chemotaxis to lysophosphatidylcholine via the immunoregulatory GPCR G2A.</a> Blood. 105 (3), 1127-1134 (2005).</li><li>Yoshida, M., Yoshida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sperm+chemotaxis+and+regulation+of+flagellar+movement+by+Ca2+.">Sperm chemotaxis and regulation of flagellar movement by Ca2+.</a> Mol. Hum. Reprod. 17 (8), 457-465 (2011).</li><li>Albini, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+and+endothelial+cell+invasion+of+basement+membranes.+The+matrigel+chemoinvasion+assay+as+a+tool+for+dissecting+molecular+mechanisms.">Tumor and endothelial cell invasion of basement membranes. The matrigel chemoinvasion assay as a tool for dissecting molecular mechanisms.</a> Pathol. Oncol. Res. 4 (3), 230-241 (1998).</li><li>Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+determinants+of+metastasis.">Critical determinants of metastasis.</a> Semin. Cancer Biol. 12 (2), 89-96 (2002).</li><li>Steeg, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+metastasis:+mechanistic+insights+and+clinical+challenges.">Tumor metastasis: mechanistic insights and clinical challenges.</a> Nat. Med. 12 (8), 895-904 (2006).</li><li>Roussos, E. T., Condeelis, J. S., Patsialou, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+in+cancer.">Chemotaxis in cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 11 (8), 573-587 (2011).</li><li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+study+of+3D+morphology+and+functions+on+genetically+engineered+mouse+melanoma+cells.">Comparative study of 3D morphology and functions on genetically engineered mouse melanoma cells.</a> Integr. Biol. (Camb. 4 (11), 1428-1436 (2012).</li><li>Junger, W. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purinergic+regulation+of+neutrophil+chemotaxis.">Purinergic regulation of neutrophil chemotaxis.</a> Cell. Mol. Life Sci. 65 (16), 2528-2540 (2008).</li><li>Lazennec, G., Richmond, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+chemokine+receptors:+new+insights+into+cancer-related+inflammation.">Chemokines and chemokine receptors: new insights into cancer-related inflammation.</a> Trends Mol. Med. 16 (3), 133-144 (2010).</li><li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells.">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> J. Biomed. Sci. 17, (2010).</li><li>Cortesio, C. L., Boateng, L. R., Piazza, T. M., Bennin, D. A., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calpain-mediated+proteolysis+of+paxillin+negatively+regulates+focal+adhesion+dynamics+and+cell+migration.">Calpain-mediated proteolysis of paxillin negatively regulates focal adhesion dynamics and cell migration.</a> J. Biol. Chem. 286 (12), 9998-10006 (2011).</li><li>Wehrle-Haller, B., Imhof, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+microtubules+and+focal+adhesion+dynamics+during+cell+migration.">Actin microtubules and focal adhesion dynamics during cell migration.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 35 (1), 39-50 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

נדידת תאים היא היבט חשוב ללמוד בחקר סרטן וזה יכול להיות מיושם גם ללימודי ריפוי התפתחותיים, חיסוניים ופצע. תרבית התאים בסופו של assay סגר ומבחני נדידת תאי transwell והפלישה לחשוף מידע מפורט של התנהגויות נדידת תאים ויכולים לשמש כדי לחקור את המנגנונים המולקולריים של תא הגירה <...

תנועתיות היא תכונה חיונית של תאי חיים. נדידת תאים מעורבת בתפיסה של חיים, התפתחות עוברית, תגובה חיסונית, ורבים תהליכים פתולוגיים כגון גרורות סרטן ודלקת 1-9. לכן, שיטות ללמוד התנהגות נדידה סלולרי הן כלי מחקר שימושיים מאוד עבור מגוון רחב של תחומים במדעים ביו ושדות, ביולוגיה, הנדסה גנטיות, קשורים. המחקר של נדידת תאים בחקר הסרטן הוא עניין מיוחד כגורם העיקרי למוות בחולי סרטן קשור להתקדמות גרורתי. על מנת שהסרטן להתפשט ולהפיץ בכל הגוף, תאים סרטניים חייבים לנדוד ולפלוש דרך מטריצה ​​תאית (ECM), intravasate למחזור דם, לצרף לאתר מרוחק, ובסופו extravasate כדי ליצור מוקדים רחוקים 1,10-12. שיטות ביולוגיות שונות עשויות להיות מועסקות על מנת ללמוד את האירועים הללו בפירוט. פצע סגר תרבית התאיםמבחני ד הגירת transwell והפלישה נמצאים בשימוש נרחב בקהילה המדעית 1,10. בדיקות אלה יכולות לספק את הנתונים הדרושים שעשויות לאפשר הבנה של אופן שגם סוג תא מסוים באופן ספונטני יכול להעביר או להגיב להכימותרפיה attractant וdirectionally להגר אליה. כמה פנוטיפים נודדים כבר תיארו. תאים עשויים לנדוד בצורת תא בודדת כגון ראתה בmesenchymal או תנועה כמו אמבואידית-או על ידי תנועה רב תאית שכותרת הגירה קולקטיבית או תא הזרמה 13. השיטה של ​​תנועה המשמשת בתאי ניעתי ניתן לראות בקלות באמצעות assay סגירת פצע תרבית תאים. בין הדרכים הרבות ללמוד נדידת תאים, assay סגירת פצע התא הוא אחד הפשוט ביותר. שיטה זו שימושית כדי לקבוע את יכולת הנדידה של המוני תא כולו. כאשר נלקחו צעד נוסף ניתן להשתמש בו כדי לצפות במאפיינים המורפולוגיים של התאים בודדים במהלך הנדידה 14. בעקבות הניתוח של סגירת פצע פנוטיפים רבים עשויים להתגלות. מדידת המרחק הסגור לאורך זמן בהשוואה לשליטה עשויה לחשוף שינויי הגירה ספציפיים או הפנוטיפ נודד לקוי שהיה ידוע קודם לכן. יתר על כן, היווצרות אחת lamellipodium התא, הכחשה זנב, ותנועה כיוונית עשויות לתת רמזים למה שעלול להיפגע או משופר בתאים של עניין 14. הגירת transwell ומבחני פלישה ניתן להשתמש כדי לנתח את היכולת של תאים בודדים להגיב directionally להכימותרפיה משיכה שונות בין אם הם כמוקינים, גורמי גדילה, שומנים, או נוקלאוטידים 4,5,8,15,16. היא עשויה גם להעריך את יכולת נדידת ההפרש נובעת מביטוי היתר של קולטן 1,14. גם מבחני אלה יכולים לשמש כדי לזהות ולאפיין את הרגולטורים המרכזיים של נדידת תאים כמו משפחת Rho של GTPases הקטן 2. בעקבות קצר אלה בקלות ובaccesבדיקות sible, במצב של נדידת תאים ואת היכולת של תא לפלוש לתוך מטריצת 3-D יכולים גם להיות נחושות.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s modified Eagle medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum (FBS)</td><td>Gemini</td><td>100106</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin EDTA 0.25%</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s phosphate buffered saline (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Crystal violet</td><td>Sigma</td><td>C0775-100G</td><td>Dissolved in water at 0.2%</td></tr><tr><td>Cell disassociation buffer</td><td>Gibco</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture incubator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # 3145</td></tr><tr><td>SterilGARD biosafety hood</td><td>The Baker Company, Inc.&amp;nbsp;</td><td></td><td>Model # VBM-600</td></tr><tr><td>EVOS Fl inverted microscope</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # AMF-4302-US</td></tr><tr><td>Tissue culture plate</td><td>Becton Dickinson</td><td>353046</td><td>Catalog number varies depending on the type of culture plate</td></tr><tr><td>Corning Transwell insert</td><td>Fisher</td><td>07-200-150</td><td>Catalog number varies depending on the pore size of the membrane</td></tr></tbody></table>

in vitro cell migration and invasion assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

Assay פצע הסגר וassay נדידת תאי transwell מוצג כאן בוצעו באמצעות תאים מלנומה B16F10 העכבר כמודל למערכת. ב assay סגירת פצע, B16F10 תאי זרע בצלחת תרבית רקמת 6 היטב ומבוגר כדי מפגש 100% ב24 שעות. פצע של רחב כ 700 מיקרומטר נוצר באמצעות פיפטה קצה וסגירת הפצע (נדידת תאים) נרשם באמצעות מיקרוסקופיה הז...

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Cell Migration and Invasion Assays at JoVE.com

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

בשימוש נפוץ, שיטות נגישות ביותר לבחינת נדידת תאים ופלישה במבחנה מתוארות. השיטה הראשונה היא assay סגירת פצע תא המודד את תנועתיות תא. השיטה השנייה היא assay ההגירה והפלישה transwell שמעריך את chemotactic וקיבולת פולשני של תאים.

נדידת תאים במבחנה ומבחני פלישה

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

in-vitro-cell-migration-and-invasion-assays

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Cell Biology

Biology

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Unit 1

Cell Polarization and Migration

SCIENTISTS IN ACTION

137.6K Views.  East Carolina University.  בשימוש נפוץ, שיטות נגישות ביותר לבחינת נדידת תאים ופלישה במבחנה מתוארות. השיטה הראשונה היא assay סגירת פצע תא המודד את תנועתיות תא. השיטה השנייה היא assay ההגירה והפלישה transwell שמעריך את chemotactic וקיבולת פולשני של תאים. 

Video: In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

הערכה של נדידת תאי האנדותל לאחר חשיפה לכימיקלים רעילים

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

Developmental Biology

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

הערכה של הפלישה התא, תהליך ההעברה: השוואה של השריטה מבוסס-מיקרוסקופ וידאו פצע Assay ואת וזמינותו קאמרית בוידן

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

Cancer Research

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. Traditional 3D assays such as the Boyden Chamber require that cells are displaced from the original culture location and moved to a new environment. Not only does this disrupt the cellular processes that are intrinsic to the microenvironment, but it often results in a loss of cells. These problems are especially challenging when dealing with cells that are either rare, or extremely sensitive to their microenvironment. Here, we describe the development of a 3D invasion assay that avoids both concerns. In this assay, cells are plated within a small well and an ECM matrix containing a chemoattractant is laid atop the cells. This requires no cell displacement, and allows the cells to invade upwards into the matrix. In this assay, cell invasion as well as cell morphology can be assessed within the collagen gel. Using this assay, we characterize the invasive capacity of rare and sensitive cells; the hybrid cells resulting from fusion between breast cancer cells MCF7 and mesenchymal/multipotent stem/stroma cells (MSCs).

Moving Upwards: A Simple and Flexible In Vitro Three-dimensional Invasion Assay Protocol

This protocol describes an inverted vertical invasion assay that could be used to quantify the migration and invasion capabilities of cells in a three-dimensional setting while preserving the cell microenvironment. This assay is suitable for rare and/or sensitive cells.

נעים כלפי מעלה: פשוט וגמיש במבחנה הפלישה תלת מימדי Assay פרוטוקול

Although 3D invasion assays have been developed, the challenge remains to study cells without affecting the integrity of their microenvironment. ...

Live-Cell Imaging Assays to Study Glioblastoma Brain Tumor Stem Cell Migration and Invasion

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include rapid proliferation and pervasive invasion into the normal brain. Recurrence is thought to result from the presence of radio- and chemo-resistant brain tumor stem cells (BTSCs) that invade away from the initial cancerous mass and, thus, evade surgical resection. Hence, therapies that target BTSCs and their invasive abilities may improve the otherwise poor prognosis of this disease. Our group and others have successfully established and characterized BTSC cultures from GBM patient samples. These BTSC cultures demonstrate fundamental cancer stem cell properties such as clonogenic self-renewal, multi-lineage differentiation, and tumor initiation in immune-deficient mice. In order to improve on the current therapeutic approaches for GBM, a better understanding of the mechanisms of BTSC migration and invasion is necessary. In GBM, the study of migration and invasion is restricted, in part, due to the limitations of existing techniques which do not fully account for the in vitro growth characteristics of BTSCs grown as neurospheres. Here, we describe rapid and quantitative live-cell imaging assays to study both the migration and invasion properties of BTSCs. The first method described is the BTSC migration assay which measures the migration toward a chemoattractant gradient. The second method described is the BTSC invasion assay which images and quantifies a cellular invasion from neurospheres into a matrix. The assays described here are used for the quantification of BTSC migration and invasion over time and under different treatment conditions.

Here, we describe live-cell imaging techniques to quantitatively measure the migration and invasion of glioblastoma brain tumor stem cells over time and under multiple treatment conditions.

מבחני הדמיה לחיות תאים מחקר המוח גליובלסטומה גידול תאי גזע ההעברה, הפלישה

Glioblastoma (GBM) is an aggressive brain tumor that is poorly controlled with the currently available treatment options. Key features of GBMs include ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

זרימת עבודה פשוטה הגירה/הפלישה באמצעות Imager אוטומטיות של תאים חיים

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

The Use of Mouse Mammary Tumor Cells in an In Vitro Invasion Assay as a Measure of Oncogenic Cell Behavior

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a porous membrane in a process analogous to the initial steps of cancer cell metastasis. The tested cells can be altered for the gene expression or treated with inhibitors to test for changes in the invasion potential. This experiment tests the aggressive phenotype of the mouse mammary tumor cells to discover and characterize the potential oncogenes that promote cell invasion. This technique, however, can be versatile and adapted to many different applications. The experiment itself can be done in one day and the results are acquired by light microscopy in less than a day. The results include counts of the number of invading cells for comparison and analysis. The in vitro invasion assay is a rapid, inexpensive, and clear-cut method for determining cell behavior in a culture that can be used as an initial assessment before more involved in vivo assays.

The in vitro cell invasion assay is used to measure the potential of cancer metastasis by quantifying the cellular potential for invasion and migration using cell culture inserts containing protein matrix. Cells are challenged to migrate through the protein matrix and a porous membrane, towards a chemoattractant, and then quantified by light microscopy.

השימוש של העכבר בתאי סרטן הגידול בתוך שיטת הפלישה מחוץ למבחנה כמדד של התנהגות התא אונגניים

The in vitro invasion assay uses a protein-rich matrix in a Boyden chamber to measure the ability of cultured cells to pass through the matrix and a ...

Genetics

In Vitro Assays to Evaluate the Migration, Invasion, and Proliferation of Immortalized Human First-trimester Trophoblast Cell Lines

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration and invasion is demonstrated by pregnancy disorders such as pre-eclampsia and intrauterine growth restriction, which are associated with inadequate trophoblast invasion of the maternal vasculature. Unfortunately, our understanding of the mechanisms by which the placenta develops from migrating trophoblasts is limited. In vitro analysis of cell migration via the scratch assay is a useful tool in identifying factors that regulate trophoblast migratory capacity. However, this assay alone does not define the cellular changes that can result in altered cell migration. This protocol describes three different in vitro assays that are used collectively to evaluate trophoblast cell movement: the scratch assay, the invasion assay, and the proliferation assay. The protocols described here may also be modified for use in other cell lines to quantify cell movement in response to stimuli. These methods allow investigators to identify individual factors that contribute to the cell movement and provide a thorough examination of potential mechanisms underlying apparent changes in cell migration.

Here, we present a highly accessible protocol for evaluating the cell movement in human trophoblast cells using three in vitro assays: the scratch assay, the transwell invasion assay, and the cell proliferation assay.

במבחני חוץ גופית כדי להעריך את ההעברה הפלישה, התפשטות של שורות תאים מונצחים Trophoblast בטרימסטר הראשון אנושי

Cell movement is a critical property of trophoblasts during placental development and early pregnancy. The significance of proper trophoblast migration ...

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the actual molecules towards which the cells migrate remain elusive. This modified invasion assay has been developed to identify targets which drive cell migration and invasion. This technique compares the invasion index under three conditions to determine whether a specific hormone, growth factor, or cytokine plays a role in mediating the invasive potential of a cancer cell. These conditions include i) normal fetal bovine serum (FBS), ii) charcoal-stripped FBS (CS-FBS), which removes hormones, growth factors, and cytokines and iii) CS-FBS + molecule (denoted &#8220;X&#8221;). A significant change in cell invasion with CS-FBS as compared to FBS, indicates the involvement of hormones, cytokines or growth factors in mediating the change. Individual molecules can then be added back to CS-FBS to assay their ability to reverse or rescue the invasion phenotype. Furthermore, two or more factors can be combined to evaluate the additive or synergistic effects of multiple molecules in driving or inhibiting invasion. Overall, this method enables the investigator to determine whether hormones, cytokines, and/or growth factors play a role in cell invasion by serving as chemoattractants or inhibitors of invasion for a particular type of cancer cell or a specific mutant. By identifying specific chemoattractants and inhibitors, this modified invasion assay may help to elucidate signaling pathways that direct cancer cell invasion.

A Modified In vitro Invasion Assay to Determine the Potential Role of Hormones, Cytokines and/or Growth Factors in Mediating Cancer Cell Invasion

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

השתנה<em&gt; במבחנה</em&gt; פלישת Assay כדי לקבוע את התפקיד הפוטנציאלי של הורמונים, ציטוקינים ו / או גורמי גדילה בפלישת תאי הסרטן המתווך

Blood serum serves as a chemoattractant towards which cancer cells migrate and invade, facilitating their intravasation into microvessels. However, the ...

Medicine

Real-Time Quantitative Measurement of Tumor Cell Migration and Invasion Following Synthetic mRNA Transfection

Tumor cells are highly motile and invasive and display altered gene expression patterns. Knowledge of how changes in gene expression regulate tumor cell migration and invasion is essential for understanding the mechanisms of tumor cell infiltration into neighboring healthy tissues and metastasis. Previously, it was demonstrated that gene knockdown followed by the impedance-based real-time measurement of tumor cell migration and invasion enables the identification of the genes required for tumor cell migration and invasion. Recently, the mRNA vaccines against SARS-CoV-2 have increased interest in using synthetic mRNA for therapeutic purposes. Here, the method using synthetic mRNA was revised to study the effect of gene overexpression on tumor cell migration and invasion. This study demonstrates that elevated gene expression with synthetic mRNA transfection followed by impedance-based real-time measurement may help identify the genes that stimulate tumor cell migration and invasion. This method paper provides important details on the procedures for examining the effect of altered gene expression on tumor cell migration and invasion.

Many upregulated genes stimulate tumor cell migration and invasion, leading to poor prognosis. Determining which genes regulate tumor cell migration and invasion is critical. This protocol presents a method for investigating the effects of the increased expression of a gene on the migration and invasion of tumor cells in real time.

מדידה כמותית בזמן אמת של נדידת תאי גידול ופלישת תאים סרטניים בעקבות טרנספקציה סינתטית של mRNA

Tumor cells are highly motile and invasive and display altered gene expression patterns. Knowledge of how changes in gene expression regulate tumor cell ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

הרומן במבחנה פצע ריפוי הנועד להעריך את נדידת תאים

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...