Bu protokol kullanılarak hücre göçü ve istilası, hücre kinetiklerinin gen fonksiyonu nun ve ilaçların kaybı veya kazanımı altında belirlenmesini sağlayan gerçek zamanlı koşullar altında açıklanabilir. Diğer yöntemlerin aksine, hiçbir boyama, mekanik hücre hasarı, ya da floresan belirteçleri gerekli. En önemlisi, gerçek zamanlı hücre kinetik etkili bir şekilde belirlenebilir.
U-118MG hücre hattı kültürü %70 ila %80 biraraya geldiğinde, hücreleri %0,5 tripsin-EDTA'nın iki mililitresi ile tedavi etmeden önce hücreleri PBS ile yıkayın. 37 santigrat derecede 30 saniye sonra, 10 mililitre taze kültür ortamı ile reaksiyonu durdurun ve müstakil hücreleri 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Sayma sonra, santrifüj ile hücreleri toplamak ve taze orta uygun hacimde durum konsantrasyonu başına beşinci hücrelere altı kez 10 pelet resuspend.
Beşinci hücrelere altı kez 10'u her koşulda bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve her tüpe 800 mikrolitre Dulbecco'nun PBS'sini ekleyin. Santrifüjden sonra, her peletin 60 mikrolitre resuspension tampon R'sinde ve siRNA'nın altı mikromonunda yeniden askıya alınması. Üç 10 milisaniyelik 1, 350 volt darbeler ile her hücre süspansiyon 10 mikrolitre aliquots elektroporating önce nazik dokunarak her tüp karıştırın.
Her tedaviden sonra, taze kültür ortamının tek tek beş mililitre aliquots her durumdan elektroporated hücreleri havuz. Daha sonra hücreleri her koşulda 35 milimetrelik iki kültür yemeğine yerleştirin ve hücreleri üç gün boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. Gerçek zamanlı hücre analizinden 5-6 saat önce, gerçek zamanlı hücre analiz sistemini hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin.
Bir istila teşpini ayarlamak için, hücre istilası plakasının üst haznesinin her bir kuyusuna hücre dışı matris jelin mililitrebaşına 0,1 mikrogram ile takviye edilmiş 50 mikrolitre DMEM yerleştirmek için ters pipetleme kullanın. Kaplamadan hemen sonra, her kuyudan hücre dışı matris çözeltisinin 30 mikrolitresini çıkarın ve plakayı dört saat boyunca hücre kültürü kuluçka makinesine yerleştirin. Bir empedans ölçüm programı kurmak için, ölçümden altı saat önce, elektrohaplı hücre kültürlerinin tümlerinde ortamı düşük serum ortamıile değiştirin.
İlişkili empedans ölçüm yazılımındaki Düzen sekmesi altında, her biyolojik durum için dört lü kuyuları seçin. Zamanlama sekmesinin altında, bir dakika arayla bir kerelik temel ölçüm tarama adımı ayarlayın ve gerçek deneme için ilgili tek beşikteki hücre empedansını ölçmek için ikinci bir adım ayarlayın. Hücre empedansı ölçümübaşlamadan bir saat önce, hücre istilası ve göç plakasının alt odasının kuyularına kemoattractant olarak %10 fetal sığır serumu ile takviye edilmiş 160 mikrolitre orta ekleyin.
İstilayı ölçmek için, ekstrasellüler matris jel kaplı kuyular içeren üst oda monte. Geçişi ölçmek için, üst bölmede kaplamasız kuyular kullanın. Her iki deney türü için de üst odadaki kuyuları 50 mikrolitre düşük serum ortamıyla doldurun ve odaları sistemin beşiğine yerleştirin.
Tüm kuyuların denetim birimi tarafından tanınıp tanınmadığını belirlemek için yazılımdaki İleti sekmesini tıklatın. İleti beklendiği gibi görüntülerse, beşikteki plaka deneme için hazırdır. Daha sonra hücre kültürü koşullarına uygun bir saat için gerçek zamanlı hücre analiz sistemi beşiği nde hücre kültürü kuluçka içine tamamen paketlenmiş plakalar yerleştirin.
Plakalar dengelenirken, glioblastoma hücrelerini gösterildiği gibi hasat edin ve düşük serum orta konsantrasyonuna sahip 800 mikrolitredeki 5 0'dan 5'e kadar her durumdan hücreleri sekiz kez 10'a kadar yeniden askıya alın. Ayrıca, aşağı Batı leke analizi için 35 milimetrelik bir çanak tohumlama için kültür orta iki mililitre beşinci hücrelere üç kez 10 bir kenara koyun. Temel geçiş öncesi okumayı ölçmek için, alışma sonunda, beşik Başlat düğmesini tıklatın.
Temel ölçüm alındıktan sonra, göç ve istila plakalarını beşiklerinden bir biyogüvenlik kabine aktarın. Ters pipet 100 mikrolitre hücre nin dört katına kadar üst hazne kuyuları her biyolojik durum için hücre istilası ve göç plakaları uygun kuyuda beşiğin kontrol ünitesinde programlanmış olarak. Tohumlamadan sonra, hücreleri kendi beşiklerine aktarmadan önce plakaları plaka alt eşit yerleşmek için izin oda sıcaklığında 30 dakika boyunca biyogüvenlik kabininde plakaları tutun.
Hücre empedansını ölçmeye başlamak için beşik Başlat düğmesini tıklatın. Denemenin tamamlanması sırasında veya tamamlanmasından sonra zamana bağlı bir şekilde hücre indeksi olarak hücre empedansı değişiklikleri görselleştirmek için Veri Analizi sekmesini açın. İlgili koşulların her biri için verileri tek tek veya ortalamalar ve/veya standart sapmalar olarak görselleştirmek için, ortalama ve standart sapma için seçenek kutularını tıklatın.
Hücre dizini verilerini elektronik tablo dosyasına dışa aktarmak için imleci veri çözümleme penceresinin ortasına yerleştirin ve sağ tıklatın. Görünen diyalog kutusunda, verileri liste biçimi seçeneğine kopyala seçeneğini belirleyin ve verileri açık bir elektronik tabloya yapıştırın. Denemeyi serbest bırakmak için, her beşikteki Serbest Bırakma düğmesini tıklatın.
Crk adaptörü protein nakavt Crk1 ve Crk2 protein düzeylerini sırasıyla% 85 ve% 86 oranında Crk benzeri protein düzeyleri indüklemeden azaltır. Crk benzeri nakavt Crk1 ve Crk2 protein düzeylerinde hafif azalmalar ile% 85 Crk benzeri protein ekspresyonu azaltır. Her iki siRNA'nın birleştirilmesi Crk1, Crk2 ve Crk benzeri ifadeyi %80'in üzerinde azaltırken, ne Vinculin ne de alfa-Tubulin ifadesi Crk veya Crk benzeri nakavtın herhangi bir kombinasyonundan etkilenmez.
İnsan beyni glioblastom hücreleri 13 saat en yüksek göç seviyesine ulaşan yüksek serum konsantrasyonlarına yanıt olarak bir degrade boyunca göç ederler. Crk knockdown hücrelerinde, geçiş başlangıçta gecikmiş olsa da, hücreler 23 saate kadar göç etmeye devam etti. Crk benzeri nakavt, glioblastoma hücre hattının hem Crk hem de Crk benzeri bir şekilde yıkılması üzerine göçmenlik yeteneğini tamamen kaybetmesi ile hücre göçlerini önemli ölçüde azaltır ve crk ve Crk benzeri kanser hücresi göçünde temel örtüşen rolleri oynar.
Ancak, hücre istilası birkaç gün içinde izlendiğinde, Crk knockdown hücreleri crk benzeri hücreler kısmen 90 saat ve çift Crk-Crk hücreleri 40 saat sonra işgal yeteneğini azaltılmış gösteren ile 60 saat glioblastoma hücreleri kontrol ile karşılaştırıldığında hücre invazyonu benzer bir maksimum seviyeye ulaşır. Sonuçlar, hücre istilasının deney boyunca analiz edilmesi gerektiği önerisini açıkça desteklemez. Doğru sayıda hücre tohumlama ve istila için ekstrasellüler matris kaydederken hava kabarcıkları kaçınarak ve tohum hücreleri bu deneyin başarısı için önemli noktalardır.
Benzer prosedürü takip ancak e-plakalar kullanılarak hücre adezyonu ve hücre çoğalması kinetikleri belirlenebilir.
