Usando este protocolo, a migração celular e a invasão podem ser reveladas em condições em tempo real, permitindo que a cinética celular sob perda ou ganho de função genética e drogas sejam determinadas. Ao contrário de outros métodos, não é necessário coloração, dano celular mecânico ou marcadores fluorescentes. Mais importante, a cinética celular em tempo real pode ser determinada de forma eficaz.
Quando a cultura da linha celular U-118MG atingir 70 a 80% de confluência, lave as células com PBS antes de tratar as células com dois mililitros de 0,5% de trippsina-EDTA. Após 30 segundos a 37 graus Celsius, pare a reação com 10 mililitros de cultura fresca e transfira as células separadas para um tubo cônico de 15 mililitros. Após a contagem, colete as células por centrifugação e resuspense a pelota em seis vezes 10 para a quinta célula por concentração de condição no volume adequado de meio fresco.
Transfira seis vezes 10 para as quintas células em um tubo de microcentrífuga por condição e adicione 800 microliters de PBS de Dulbecco a cada tubo. Após a centrifugação, resuspengue cada pelota em 60 microliters de tampão de resuspensão R e seis micromolar do siRNA de interesse. Misture cada tubo com toques suaves antes de eletroporar 10 alíquotas de microliter de cada suspensão celular com três pulsos de 10 milissegundos de 1,350 volts.
Após cada tratamento, acumule as células eletroporadas de cada condição em alíquotas individuais de cinco mililitros de meio de cultura fresca. Em seguida, semeou as células em dois pratos de cultura de 35 milímetros por condição e colocar as células na incubadora de cultura celular por três dias. Cinco a seis horas antes da análise celular em tempo real, coloque o sistema de análise celular em tempo real na incubadora de cultura celular.
Para configurar um ensaio de invasão, use tubulação reversa para colocar 50 microliters de DMEM suplementados com 0,1 micrograma por mililitro de gel de matriz extracelular em cada poço da câmara superior de uma placa de invasão celular. Imediatamente após o revestimento, remova 30 microliters da solução de matriz extracelular de cada poço e coloque a placa na incubadora de cultura celular por quatro horas. Para configurar um programa de medição de impedância, seis horas antes da medição, substitua o meio em todas as culturas de células eletroporadas por meio de soro baixo.
Sob a guia Layout no software de medição de impedância associado, selecione poços quadruplicados para cada condição biológica. Na guia Agendar, defina uma etapa de varredura de medição de linha de base única com um intervalo de um minuto e defina um segundo passo para medir a impedância celular nos respectivos berços individuais para o experimento real. Uma hora antes do início da medição da impedância celular, adicione 160 microliters de médio suplementado com soro bovino 10% fetal como quimioattractant nos poços da câmara inferior da placa de invasão celular e migração.
Para medir a invasão, monte a câmara superior contendo os poços revestidos de gel de matriz extracelular. Para medir a migração, use poços não revestidos na câmara superior. Para qualquer tipo de experimento, preencha os poços na câmara superior com 50 microliters de meio de soro baixo e coloque as câmaras no berço do sistema.
Clique na guia Mensagem no software para determinar se todos os poços são reconhecidos pela unidade de controle. Se a mensagem for exibida como esperado, a placa no berço está pronta para o experimento. Em seguida, coloque as placas completamente embaladas na incubadora de cultura celular no berço do sistema de análise celular em tempo real por uma hora para aclimatar a placa às condições de cultura celular.
Enquanto as placas estão se equilibrando, colde as células de glioblastoma como demonstrado e resuspensa as células de cada condição em oito vezes 10 para as quintas células por 800 microliters de baixa concentração média sérica. Além disso, reserve três vezes 10 para as quintas células em dois mililitros de cultura média para semeadura em um prato de 35 milímetros para análise de manchas ocidentais a jusante. Para medir a leitura pré-migração da linha de base, no final da aclimatação, clique no botão iniciar o berço.
Após a aquisição da medição da linha de base, transfira a migração e as placas de invasão de seus respectivos berços para um armário de biossegurança. Pipeta reversa 100 microliters de células em poços de câmara superior quadruplicando para cada condição biológica no poço apropriado da invasão celular e placas de migração como programado na unidade de controle do berço. Após a semeadura, mantenha as placas no armário de biossegurança por 30 minutos à temperatura ambiente para permitir que as células se acomodem uniformemente no fundo da placa antes de transferir as placas para seus respectivos berços.
Clique no botão iniciar o berço para começar a medir a impedância da célula. Para visualizar as alterações na impedância celular como o índice celular de forma dependente do tempo durante ou após a conclusão do experimento, abra a guia Análise de Dados. Para visualizar os dados de cada uma das respectivas condições individualmente ou como médias e/ou desvios padrão, clique nas caixas de opção para desvio médio e padrão.
Para exportar os dados do índice celular para um arquivo de planilha, coloque o cursor no meio da janela de análise de dados e clique com o botão direito do mouse. Na caixa de diálogo que aparece, selecione os dados de cópia na opção de formato de lista e cole os dados em uma planilha aberta. Para liberar o experimento, clique no botão Soltar em cada berço.
O knockdown de proteína do adaptador crk diminui os níveis de proteína crk1 e crk2 em 85% e 86%, respectivamente, sem induzir níveis de proteína semelhantes a Crk. O knockdown do tipo Crk reduz a expressão proteica semelhante ao Crk em 85% com pequenas reduções nos níveis de proteína Crk1 e Crk2. A combinação de ambas as siRNAs reduz a expressão crk1, Crk2 e crk em mais de 80%, enquanto nem a expressão vinculina nem alfa-tubulin é afetada por qualquer combinação de knockdown semelhante a Crk ou Crk.
As células de glioblastoma cerebral humano migram ao longo de um gradiente em resposta a altas concentrações de soro atingindo o nível máximo de migração em 13 horas. Nas células de knockdown de Crk, embora a migração seja inicialmente adiada, as células continuaram a migrar até 23 horas. O knockdown semelhante a CRK reduz substancialmente a migração celular com a linha celular glioblastoma perdendo completamente sua capacidade migratória após o knockdown tanto do Crk quanto do Crk sugerindo que crk e crk-like desempenham papéis essenciais sobrepostos na migração de células cancerosas.
No entanto, quando a invasão celular é monitorada ao longo de vários dias, as células de knockdown crk atingem um nível máximo semelhante de invasão celular em comparação com as células de glioblastoma de controle em 60 horas com células semelhantes a Crk recuperando parcialmente sua capacidade invasiva em 90 horas e células crk-crk duplas demonstrando uma capacidade reduzida de invadir após 40 horas. Os resultados apoiam claramente a sugestão de que a invasão celular deve ser analisada durante todo o período do experimento. Semear o número certo de células e evitar as bolhas de ar ao registrar a matriz extracelular para ensaios de invasão e células de semeadura são pontos-chave para o sucesso deste experimento.
Seguindo procedimento semelhante, mas usando placas e, a adesão celular e cinética de proliferação celular podem ser determinadas.
