ניתוח מיקרוסקופיה אלקטרונית הוא לעתים קרובות מורכב. אנו מאמינים כי הפרוטוקול שלנו מאפשר עיבוד ורכישה של נתוני EM מפני השטח הדגימה הגדולה ונפח הביניים. הפרוטוקול שלנו עוזר למצוא מבני יעד במקטעים סידוריים.
הקלטת נתונים מוגבלת למה שנחוץ. בהשוואה לרכישת נתונים בלוקים של רקמות שלמות, זמן ההקלטה מצטמצם וניתוח נתונים קל יותר. בהתחשב בקלות הכוללת של הגישה, אנו מאמינים כי ניתן להשתמש בה כדי לטפל לא רק בשאלות מדעיות, אלא גם ככלי אבחון.
כדי ליצור מערך לניתוח, תחילה להדק את המדגם על מחזיק ultramicrotome ולהשתמש סכין גילוח כדי לקצץ בערך את השרף סביב המדגם. השתמש בכלי חיתוך יהלום כדי לקצץ דק את הדגימה ולהשתמש בסכיני חיתוך של נטייה של 20 או 90 מעלות כדי להבטיח שהמשטחים העליונים והתחתוניים של הבלוק מקבילים לחוד החנית של הסכין. מערבבים קסילן ודבק בפרופורציה של 3:1 ומשתמשים בריס המחובר לקיסם כדי להחיל את התערובת על הקצוות העליונים והתחתונים של הבלוק החתוך.
בזמן שהתערובת מתייבשת, השתמשו בכלי מחשוף רקיק כדי לחתוך חתיכת רקיק לגודל המתאים לניתוח. נקו את הוופל במים מזוקקים כדי לשטוף את כל הפסולת ולנקות את פני השטח עם פלזמה לאחר שהוופל יבש. להכנת סכין טומוגרפיה מערך, השתמשו בסרט דביק מוקצף כדי לחבר מחט לתחתית סכין היסטו ג'מבו ומניחים את הסכין במחזיק המיקרוטומי האולטרה באפס מעלות.
התאימו את קצה הסכין במקביל למשטח הבלוק והבנו את הבלוק החתוך לקצה הסכין בתנוחה המוכנה לחיתוך. מניחים את הוופל הנקי לתוך אגן הסכין וממלאים את האגן במים באותה רמה כמו קצה הסכין, ולאחר מכן, תן לקצה היהלום של הסכין לח כראוי, תוך שימוש במזרק המצורף כדי להוסיף או למשוך מים לפי הצורך. עבור חתך מערך, להגדיר את microtome לטווח חיתוך של 50 עד 100 ננומטר ומהירות חיתוך של 6 עד 1 מילימטרים לשנייה, ולהתחיל לחתוך כדי לקבל סרט ארוך מספיק כדי לכסות נפח Z ממוקד.
בהתאם לגודל הבלוק, הומוגניות של הרקמה, וסוג של שרף, הסרט יהיה ישר בקירוב. השתמש בקצה נקי ולא דביק של ריס כדי לנתק את הסרטים מקצה הסכין. השתמש בריסים כדי להזיז בעדינות את רצועת הכלים למרכז מדיום התמיכה.
כלורופורם או עט חימום ניתן להשתמש כדי למתוח את החלק במידת הצורך. לאחר מתיחה, לחזור המזרק כדי להתחיל לנקז את המים. עבור סרטים עדינים יותר, או נסיגה איטית יותר במים, לנתק את המזרק מן הצינור כדי לתת למים לטפטף.
כאשר מפלס המים מגיע לרמת הוופל, דוחפים בעדינות את הסרט למרכז האגן וממשיכים להתנקז עד שכל המים הנותרים מוסרים לחלוטין מהכיור. תן לוופל להתייבש בסביבה נקייה. הייבוש אורך כ-30 דקות.
כאשר המדגם מיובש לחלוטין, להעביר את המערך לתיבה סגורה היטב כדי להגן עליו מפני זיהום לכלוך. ומניחים את הקופסה בתנור 60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות לפחות. כדי לקבל מפת מבט כולל של תמונות SEM החושפת מיקומי מקטעים על הוופל, השתמש במצלמה האופטית המובנית כדי להשיג תמונת SEM המכסה רצועת כלים של מקטעים.
ליצירת פסיפס, לחץ וגרור את תמונת המצלמה של הדוגמה והתחל את הרכישה האוטומטית. קבל סקירות כלליות ברזולוציה גבוהה יותר כדי למצוא מבני יעד. אם יש להצטייר רק מקטעים ספורים, השתמש במציג הניתן להגדלה כדי להציג תמונות שנרכשו במיקומים המקוריים שלהם.
לאחר שזוהה מקטע שיש לדמיין ברזולוציה גבוהה, לחץ וגרור כדי ליצור אזור הדמיה ולאחר מכן בחר הגדרות הדמיה ברזולוציה גבוהה ואחסן את ההגדרות בתבנית כדי למצוא אירועים נדירים קטנים במיוחד או קשים לזיהוי, השתמש בהגדרות ההדמיה ברזולוציה גבוהה בכל מקטע עשירי או במקטע אחד לכל רצועת כלים כדי ליצור באופן ידני אזור הדמיה ולהשיג את התמונות. לאחר מכן סקור את התמונות וסמן מקטעים המכילים את אזור העניין. כדי להשיג יותר מ- 10 מקטעים רצופים, השתמש ב מאתר המקטעים כדי לאתר את כל המקטעים באופן אוטומטי.
אם תמונות הסקירה הכללית אינן מציגות אזורים מעניינים ברורים, רכשו תמונות ברזולוציה גבוהה יותר של המקטעים והשתמשו בפונקציית התצוגה המקדימה של המקטע כדי ליצור ולרכוש את התמונות באופן אוטומטי. כדי לקבוע את הגדרות ההדמיה האופטימליות, הפעל את ההדמיה החיה בתוכנת בקרת המיקרוסקופ ונווט לאזור אחד של עניין, ולאחר מכן התאם את הגדרות ההדמיה עד שהתמונות יראו אזורים ברורים של עניין, אך ללא רכישת תמונה ארוכה מדי, בהתאם להנחיות היצרן. כדי למטב את המיקום של אזורי ההדמיה במקטעים רצופים, שנה גודל תצוגה לתמונה של עניין ולחץ על התחל עידון מיקום כדי להגביר את הדיוק של מיקומי מקטעים רשומים.
להגדרת אזור הדמיה, לחץ וגרור מקטע כלשהו תוך החזקת מקש Alt לחוץ ובחר צור מערך אריחים מהתפריט הנפתח תלוי ההקשר. התוכנה תיצור אזורי הדמיה באותו מיקום יחסי בכל המקטעים שנמצאו או סומנו בעבר. לאחר מכן קבעו את ספירת הפיקסלים, גודל הפיקסלים, פריסת הריוח וזמן השתהות הפיקסלים בכל סדרת תמונות לפי הצורך.
כדי לקבוע את תצורת הפונקציה האוטומטית, צור סידרת תמונות נפרדת עבור פונקציות אוטומטיות כפי שהודגם, והעבר את סידרת התמונות למיקום במקטע המכיל מבנים בעלי ניגודיות גבוהה. הגדר את סדרת התמונות ל- 1024 x 884 פיקסלים ובחר גודל פיקסל המתאים לרזולוציה הגבוהה ביותר המשמשת בסדרת התמונות. ברשימת הפונקציות האוטומטיות, סמן את המוקד האוטומטי ואת הסטיגמה האוטומטית.
בחר Bisection בפקדי רצף הרכישה ואשר שתמונת הפונקציה האוטומטית היא הפריט הראשון ברשימה ולאחר מכן לחץ על השג הכל כדי להתחיל ברכישת התמונה. כאשר כל סדרות ההדמיה נוצרו והוקמו, הסידרה תופיע בתור משימות. רכישה ברזולוציה נמוכה יכולה להתבצע באופן ידני או אוטומטי ישירות בחלקים נבחרים של המקטע או במקטע שלם באמצעות הדמיית פסיפס יחיד או פסיפס, ואחריו תפירה.
לאחר מכן ניתן לרכוש תמונות מהאזור שנבחר באמצעות פרמטרים ברזולוציה גבוהה כדי לדמיין מיטוכונדריה, גרעינים ומיקרובילי, לדוגמה, לאחר הרכישה האוטומטית של מפות פסיפס שנפתרו, ניתן לחתוך או להשתמש בכמה אזורים מעניינים כדי להגדיר אזורי הדמיה מקומיים נוספים בתוך האזורים. למרות סוגי תאים מיוחדים שונים במעי Drosophila מופצים באופן אקראי, הם יכולים להיות מובחנים חזותית לאחר הקרנת התמונות באמצעות פרמטרים ברזולוציה גבוהה, או מקטעים בודדים או כאוסף של תמונות סדרתיות. לאחר היישור, ניתן לעבד את הערימות באמצעות פתרונות תוכנה שונים.
ניתוח טומוגרפיה של מערך מאפשר ליצור מקטעים רציפים רבים על הוופל היחיד, ולהיבדק באמצעות פרמטרים ברזולוציה נמוכה כדי להתאים את תחומי העניין הכלליים. ניתן למקד אזורים אלה לניתוח נוסף באמצעות פרמטרי רכישה מתקדמים. לדוגמה, חלוקות מיטוטיות ב notum אינם קלים לוקליזציה ברמה האולטרה מבנית, שכן התאים גדולים יחסית לעומת אזור ההימנעות.
עם זאת, באמצעות שיטה זו, ניתן להשתמש בתמונות הסקירה האוטומטיות ברזולוציה בינונית של הקפיצות של 20 עד 40 מקטעים כדי להתאים את התאים המפרידים לשפות שונות. הליך טומוגרפיה של המערך מספק ניתוח נתוני מיקרוסקופיה אלקטרונים פשוט יותר. אנו מעודדים את הצופים להשקיע בשליטה על ההתחדשות ובהיכרות עם זרימת העבודה הקשורה למפות מניסיוננו, מעטים נושאי המחקר הדורשים ניתוח אולטרה מבני של בעלי חיים שלמים או איברים שלמים.
השיטה שלנו מסייעת עם לוקליזציה מהירה של תאים ושותפי אינטראקציה שלהם ברקמות.
