Анализ электронной микроскопии часто бывает сложным. Мы считаем, что наш протокол облегчает обработку и получение электромагнитных данных с большой поверхности образца и промежуточного объема. Наш протокол помогает находить целевые структуры в последовательных секциях.
Запись данных ограничена тем, что необходимо. По сравнению со сбором данных в цельнотказных блоках время записи сокращается, а анализ данных упрощается. Учитывая общую легкость подхода, мы считаем, что его можно использовать не только для решения научных вопросов, но и в качестве диагностического инструмента.
Чтобы создать массив для анализа, сначала зажмите образец на держателе ультрамикротома и используйте лезвие бритвы, чтобы грубо обрезать смолу вокруг образца. Используйте инструмент для алмазной обрезки для тонкой обрезки образца и используйте обрезные ножи с наклоном 20 или 90 градусов, чтобы гарантировать, что верхняя и нижняя поверхности блока параллельны режущей кромке ножа. Смешайте ксилол и клей в пропорции 3:1 и используйте ресницу, прикрепленную к зубочистке, чтобы нанести смесь на верхний и нижний края обрезанного блока.
Пока смесь сохнет, используйте инструмент для расщепления пластин, чтобы разрезать кусок пластины до размера, подходящего для анализа. Очистите пластину в дистиллированной воде, чтобы смыть мусор и очистить поверхность плазмой после того, как пластина высохнет. Чтобы подготовить нож для томографии массива, используйте пенистую липкую ленту, чтобы прикрепить иглу к дну гисто-гигантского ножа и поместить нож в держатель ультрамикротома при нулевых градусах.
Отрегулируйте край ножа параллельно поверхности блока и поднесите обрезанный блок к краю ножа в положении, готовом к разделению. Поместите чистую пластину в таз для ножа и наполните таз водой до того же уровня, что и лезвие ножа, затем дайте алмазному краю ножа увлажниться должным образом, используя прикрепленный шприц, чтобы добавить или отвести воду по мере необходимости. Для сечения массива установите микротом на диапазон резки от 50 до 100 нанометров и скорость резания от 6 до 1 миллиметра в секунду и начните сечение, чтобы получить ленту, достаточно длинную, чтобы покрыть целевой объем Z.
В зависимости от размера блока, однородности ткани и типа смолы лента будет примерно прямой. Используйте чистый, нелипкий кончик ресницы, чтобы отсоединить ленты от края ножа. Используйте ресницу, чтобы аккуратно переместить ленту к центру поддерживающей среды.
Хлороформ или нагревательная ручка могут быть использованы для растяжения секции, если это необходимо. После растяжения втяните шприц, чтобы начать сливать воду. Для более тонких лент или более медленного втягивания воды отсоедините шприц от шланга, чтобы вода капала.
Когда уровень воды достигнет уровня пластины, осторожно протолкните ленту к центру бассейна и продолжайте слив до тех пор, пока вся оставшаяся вода не будет полностью удалена из бассейна. Дайте вафле высохнуть в чистой среде. Сушка занимает около 30 минут.
Когда образец полностью высохнет, перенесите массив в плотно закрытый ящик, чтобы защитить его от загрязнения грязью. И поместите коробку в духовку с температурой 60 градусов Цельсия не менее чем на 30 минут. Чтобы получить обзорную карту изображений SEM, которая показывает расположение секций на пластине, используйте встроенную оптическую камеру для получения изображения SEM, которое покрывает ленту секций.
Чтобы создать мозаику, щелкните и перетащите изображение образца с камеры и запустите автоматическое получение. Получайте обзоры с более высоким разрешением, чтобы найти целевые структуры. Если необходимо визуализировать только несколько разделов, используйте масштабируемый просмотрщик для просмотра полученных изображений в их исходных местах.
После того, как раздел, который должен быть изображен с высоким разрешением, был идентифицирован, щелкните и перетащите указатель, чтобы создать область изображения, затем выберите Параметры изображения с высоким разрешением и сохраните настройки в шаблоне Чтобы найти особенно маленькие или трудно обнаруживаемые редкие события, используйте параметры изображения с высоким разрешением в каждом 10-м разделе или в одном разделе на ленте, чтобы вручную создать область изображения и получить изображения. Затем просмотрите изображения и отметьте разделы, содержащие интересующую область. Чтобы получить более 10 последовательных разделов, используйте поиск разделов, чтобы автоматически найти все разделы.
Если обзорные изображения не показывают четких областей интереса, получите изображения разделов с более высоким разрешением и используйте функцию предварительного просмотра разделов для автоматического создания и получения изображений. Чтобы определить оптимальные настройки изображения, активируйте живую визуализацию в программном обеспечении управления микроскопом и перейдите к одной интересующей области, а затем отрегулируйте параметры изображения до тех пор, пока изображения не покажут четкие области интереса, но без чрезмерно длинного получения изображения, в соответствии с рекомендациями производителя. Чтобы оптимизировать позиционирование областей изображения на последовательных участках, увеличьте масштаб до интересующего изображения и нажмите кнопку Уточнение начальной позиции, чтобы повысить точность местоположений зарегистрированных секций.
Чтобы определить область изображения, щелкните и перетащите любой раздел, удерживая клавишу Alt, и выберите «Создать массив набора плиток» во всплывающем контекстном меню. Программное обеспечение будет создавать области изображения в одном и том же относительном расположении во всех разделах, которые были найдены или ранее отмечены. Затем настройте количество пикселей, размер пикселя, макет плитки и время ожидания пикселя в каждой серии изображений по мере необходимости.
Чтобы настроить функцию auto, создайте отдельный ряд изображений для автоматических функций, как показано на рисунке, и переместите серию изображений в положение в разделе, содержащем высококонтрастные структуры. Установите для серии изображений значение 1024 x 884 пикселя и выберите размер пикселя, соответствующий самому высокому разрешению, используемому в серии изображений. В списке автофункций установите флажки Автофокус и Автостигатор.
Выберите Bisection в элементах управления последовательности захвата и убедитесь, что изображение функции auto является первым элементом в списке, затем нажмите «Получить все», чтобы начать получение изображения. После создания и настройки всех серий изображений они будут перечислены в очереди заданий. Сбор данных с низким разрешением может быть выполнен вручную или автоматически непосредственно на выбранных частях секции или целой секции с использованием одиночной или мозаичной визуализации с последующей сшиванием.
Изображения из выбранной области затем могут быть получены с использованием параметров высокого разрешения для визуализации митохондрий, ядер и микроворсинок, например, после автоматического получения разрешенных мозаичных карт несколько областей, представляющих интерес, могут быть обрезаны или использованы для определения дополнительных локальных областей визуализации в областях. Хотя различные специализированные типы клеток в кишечнике дрозофилы распределены случайным образом, их можно визуально различить после скрининга изображений с использованием параметров высокого разрешения, либо из отдельных секций, либо в виде коллекции последовательных изображений. После выравнивания стеки могут быть отображены с помощью различных программных решений.
Анализ массивной томографии позволяет генерировать множество последовательных участков на одной пластине и экранировать с использованием параметров низкого разрешения для локализации общих областей, представляющих интерес. Эти области могут быть нацелены на дальнейший анализ с использованием расширенных параметров приобретения. Например, митотические деления в нотуме нелегко локализовать на ультраструктурном уровне, так как клетки относительно большие по сравнению с зоной абсциссии.
Однако, используя этот метод, автоматические обзорные изображения среднего разрешения скачков от 20 до 40 секций могут быть использованы для локализации делящихся клеток. Процедура массивной томографии обеспечивает более простой анализ данных электронной микроскопии. Мы призываем зрителей инвестировать в освоение регенерации и ознакомление с рабочим процессом, связанным с картами По нашему опыту, немногие темы исследований требуют ультраструктурного анализа целых животных или целых органов.
Наш метод помогает с быстрой локализацией клеток и их партнеров по взаимодействию в тканях.
